用k-mer分析进行基因组调查：（六）用KmerGenie一步实现

（全文约1800字）

【推荐】用Smudgeplot评估物种倍性后，用组合jellyfish+GenomeScope1.0做二倍体物种的基因组调查，用组合KMC+GenomeScope2.0做多倍体物种的基因组调查。

1. k-mer进行基因组调查的软件

k-mer进行基因组调查分为k-mer频数统计和基因组特征评估两步。

• KmerGenie可以同时实现两步。第一步k-mer频数统计和第二步基因组特征评估。
• KmerGenie第一步的结果可用于其他软件第二步基因组特征评估。
• KmerGenie可以同时分析多个预设的k-mers，并选出一个最佳基因组组装k-mer值。

2. KmerGenie 简介

• KmerGenie在2014年第一次发表，2018年最近一次更新。开发用于基因组组装的参数k的最佳值的选择。
• KmerGenie官网：http://kmergenie.bx.psu.edu/。
• 官网包含软件的下载地址，示例报告，和版本更新记录。

3. KmerGenie 安装

在KmerGenie官网：http://kmergenie.bx.psu.edu/ 下载，目前最新版是18年更新的1.7051。

安装前需要python（>=2.7）和R支持，我用的anaconda的python，安装运行完成后自动把kmergenie命令添加到了/anaconda3/bin/下面，所以不用再次把kmergenie命令添加到环境变量了。

wget http://kmergenie.bx.psu.edu/kmergenie-1.7051.tar.gz
tar -xzvf kmergenie-1.7051.tar.gz
python setup.py install
kmergenie -h

4. KmerGenie 运行

1. 命令

kmergenie fastq_list.txt -o ./sample -l 17 -k 121 -s 10 -t 4 > sample.log1.txt 2> sample.log2.txt

• fastq_list.txt文件保存着fastq文件的位置和文件名，每个文件一行。
• 默认单倍体模式，以k-mer长度17为起始，121为终止，10为间隔逐一测试；程序运行线程数4。
• 结果输出在当前路径下，以sample为结果文件前缀名。
• “sample.log1.txt”和“sample.log2.txt”分别为程序运行时的正确/错误输出日志。

2. 参数
3. --diploid：使用二倍体模式，默认是单倍体模式（haploid）。
4. --one-pass：默认是两次评估（two passes），这个参数设置用来跳过在2bp分辨率上评估k的第二次评估。
5. -k 121：最大的k-mer值，默认是121。
6. -l 15：最小的k-mer值，默认是15。
7. -s 10：在最小和最大的k-mer值间的间隔，默认是10。意味着会进行k=15,25,35...115,121的分析。
8. -e 200：程序运行内存，默认是每个线程200MB。
9. -t 8：线程数。
10. -o histograms：输出文件的前缀，默认是histograms。
11. --debug：开发者使用，输出R脚本。
12. --orig-hist：老程序的评估方法（更慢且准确性更低）。

5. KmerGenie 结果

1. 结果报告文件sample_report.html

下载所有结果文件，打开sample_report.html，报告内容包括：

• 开头以折线图的形式展示出在每种长度k-mer下，估算的基因组大小。
• 同时给出了最佳k-mer选择数值。其实就是将评估基因组总大小最高的那个k-mer值判定为最佳k-mer，为基因组组装时k-mer的选择提供参考。
• 折线图的详细说明，包括最佳k-mer的评估规则，以及当测序深度足够高时的k-mer选择等。
• 每种k-mer的频数分布图，在基因组的k-mer中可根据该图判定基因组杂合度或重复序列比例。

2. 频数分布表sample.histo
3. 包括各k-mer取值下的频数分布表sample.histo和对应的频数分布图sample.histo.pdf。
4. 如果想用某个k-mer的频数分布表做基因组特征评估，自己绘制频数分布图，可以使用sample.histo文件。
5. 所有k-mer取值评估的基因组大小记录在sample.dat
6. 包括sample.dat和sample.dat.pdf。

6. notes

1. 二倍体模式
2. 如果待测物种是低杂合低重复的简单基因组，则使用单倍体模式。
3. 如果是复杂基因组，使用二倍体模式。
4. 如果不确定基因组简单还是复杂，可以先用单倍体模式运行，根据结果中是否有明显杂合峰判断，再运行二倍体模式。
5. KmerGenie软件默认将k-mer频数曲线的纵坐标进行了log10转化
   可以通过修改脚本来更改展示效果：
6. 在脚本kmergenie-1.7051/scripts/plot_histogram.r中第110行，suppressWarnings函数的参数log='y'设置的log10转化，可以通过去除log='y'参数来展示未log10转化的原始坐标。
7. 在脚本kmergenie-1.7051/scripts/plot_histogram.r中第110行，suppressWarnings函数的参数covNormalized改为covNormalized[-c(1:5)]来过滤掉Abundance<5的区域。
8. k-mer取值
9. KmerGenie软件是用于二代数据组装基因组推荐k-mer参数的。推荐的最佳k-mer是评估基因组最大的对应的k-mer。
10. 在基因组组装时，k-mer的取值受测序深度的影响，若测序深度越高，可选择更高的k-mer进行尝试组装，以得到更长更完整的contigs序列。
11. 但若在低深度测序模式下使用较高的k-mer进行组装时，就会引入较高的错误率。表现为k-mer频数分布曲线（纵坐标未进行log10转化的）的左侧由于测序错误导致的低频k-mer数量未随着k-mer频数升高下降至最低即产生了上升趋势。
12. 用KmerGenie软件做基因组调查时，可以根据每个k-mer值的频数分布图结果选择更为合适的k-mer值做基因组特征评估。

7. references

1. KmerGenie website：http://kmergenie.bx.psu.edu/
2. KmerGenie paper：https://academic.oup.com/bioi...
3. http://blog.sciencenet.cn/blo...
4. https://www.jianshu.com/p/025...