文献阅读 | Cell Reports | 发育中上丘的单核 RNA 测序可识别神经元多样性和环路组装的候选介质

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文献介绍

文献题目： 发育中上丘的单核 RNA 测序可识别神经元多样性和环路组装的候选介质 \
研究团队： Kevin K. Park（美国迈阿密大学米勒医学院）\
发表时间： 2023-09-26 \
发表期刊： Cell Reports \
影响因子： 8.8（2023年）\
DOI： 10.1016/j.celrep.2023.113037
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摘要

上丘 (SC) 是中脑中的感觉运动结构，它整合来自多种感觉模式的输入以启动运动命令。它在发育过程中经历了特征明确的环路组装步骤，使小鼠 SC 成为研究神经连接建立的流行模型。在这里，作者对在不同发育时间点分离的小鼠 SC 进行单核 RNA 测序分析。作者的研究提供了构成小鼠发育过程中 SC 的细胞类型的转录组学景观，特别强调神经元异质性。作者报告了不同出生后年龄差异表达的基因库，其中许多基因已知调节轴突引导和突触形成。利用这些数据，作者发现 Pax7 表达仅限于 GABA 能神经元的子集。作者的数据为探究环路发育机制和识别用于操纵特定 SC 神经元群体和环路的标记提供了宝贵的资源。

前言

上丘 (SC) 是中脑中的成对感觉运动结构，接收来自多种感觉模式的输入并结合环境刺激来控制先天行为。在小鼠中，这些行为包括协调涉及眼睛和头部运动的视线转移、对迫近的物体做出逃避或冻结反应、狩猎和接近反应、以及光/暗诱导的睡眠和觉醒。

SC 可分为浅表视觉感觉层和较深层运动层，每个细分组织为多个纤维和细胞层。浅表区域由灰浅层 (SGS) 和视层（SO）组成并接受视网膜神经节细胞（RGCs）和初级视觉皮层的神经支配。较深层的细胞表达对多种方式（例如视觉、听觉和体感）的感觉刺激的敏感性，并将感觉信号转化为用于指导定向运动的运动命令。来自浅表区域的主要输出包括对丘脑枕丘和外侧中间区域的投射，这些区域投射到参与控制眼球运动的大脑皮层区域。来自更深层的投射也得到了广泛的表征，其中包括两个前往脑干和脊髓的下降投射以及前往多个感觉和运动中心的上升投射。鉴于其记录多种感觉模式并将信号协调成运动命令的能力，SC 已被广泛用于研究多感觉和感觉运动处理的原理。

在神经系统发育过程中，轴突引导和目标选择是建立适当神经环路的关键步骤。SC 一直是研究轴突支配其目标区域的机制的重要模型。因此，研究表明，在每个 SC 层内，RGC 输入相对于视野进行地形映射；视网膜的颞鼻轴沿着 SC 的前后轴投射，视网膜的背腹轴沿着 SC 的外侧-内侧轴投射。沿着这些轴的拓扑结构的形成是由 Eph 受体和 ephrin 等分子标记引起的。其他人使用转基因小鼠来证明不同的 RGC 类型投射到不同的 SC 区域，并为多种类型的 SC 神经元提供输入。

单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 和单核 RNA 测序 (snRNA-seq) 已广泛应用于中枢神经系统 (CNS)，以表征细胞异质性以及特定细胞群随时间的动态变化。在这里，作者对出生后第一个月内不同年龄的小鼠 SC 进行了 snRNA-seq 分析，以表征整个发育过程中的 SC 细胞亚型。作者的结果揭示了分子上不同的兴奋性和抑制性神经元亚型，其中许多亚型仅存在于特定的 SC 层或投射到特定的大脑区域。此外，作者发现神经元和神经胶质细胞以时间定义的方式表达与轴突引导、靶向和突触形成相关的基因。为了方便访问这些数据，作者创建了一个用户友好的门户网站，允许在发育过程中对这些数据进行比较基因表达分析：https://parklabmiami.shinyapps.io/superior-colliculus-snRNAseq/。

研究结果

1. 发育中和成熟小鼠 SC 的单核谱

某些细胞类型（例如神经元）更容易受到组织解离过程的影响，并且在 scRNA-seq 数据中代表性不足。与整个细胞相比，细胞核对机械损伤的抵抗力更强，并且可以从冷冻组织中分离出来。事实上，研究表明 snRNA-seq 分析可以提供对神经细胞类型的公正调查，因此，snRNA-seq 已成为分析神经元等易感细胞的流行选择。

为了分析 SC 在发育和成熟过程中的基因表达，作者分析了四个时间点的单核转录组：胚胎第 19 天 (E19)、出生后 P4、P8 和 P21。作者选择这些时间点是因为它们一起包含离散但重叠的发育事件，包括轴突生长、轴突靶向、拓扑图绘制、突触发生、少突胶质细胞分化、髓鞘形成以及突触细化和成熟。对于每个年龄段，作者对几只动物的 SC 区域进行了显微解剖，并将其汇集在一起。经过基于去污剂的消化和机械解离，然后使用蔗糖密度梯度离心分离细胞核后，使用 10X Genomics 基于液滴的 snRNA-seq 平台对单核悬浮液进行测序（Figure 1A）。使用 Seurat 和 Bioconductor 生物信息学工具套件完成下游聚类和分析。经过严格的质量控制（Figure S1），总共保留了 9,728 个高质量细胞核（2,585 个来自 E19、2,386 个来自 P4、2,508 个来自 P8、2,249 个来自 P21）用于下游分析。每个核平均捕获 10,451 个独特分子标识符 (UMIs)（E19 为 7,457、P4 为 9,882、P8 为 10,961、P21 为 13,928），每个核平均检测到 3,535 个基因（E19 为 3,030、P4 为 3,574、P8 为 3,644、P21 为 3,953）（Figure S1B）。

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(A) 实验设计概述。\
(B) 通过整合分析确定的所有主要细胞类型的 UMAP 图。点代表单个细胞核的基因表达谱，并按细胞类型着色。\
(C) 按发育起始时间点着色的细胞核 UMAP。\
(D) 每种细胞类型 top3 DEG 的点图。点的大小表示每组中检测到基因的细胞的百分比。点的颜色表示中心化和 z-scaled 对数归一化表达值。\
(E) 用于注释细胞类型的先前从文献中鉴定出的标记基因。\
(F) 不同年龄的细胞类型比例的量化。
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2. 发育中小鼠 SC 中细胞类型的鉴定

为了识别 SC 发育过程中共享和独特的细胞类型，作者使用 Seurat 整合管道联合分析所有四个时间点的细胞并执行无监督聚类（参见 STAR Methods）。将细胞投影到 UMAP 图上，揭示了暗示细胞谱系和分化的结构（Figures 1B and 1C）。使用每个 cluster 的 top 差异表达基因 (DEGs) 和一组先前描述的细胞类型标记基因（例如，Slc17a6、GAD1、Aqp4、Gfap、Cspg4、Bmp4、Mbp、Mki67、P2ry12、Cldn5、Col1a1 和 Cdh1；Figures 1D and 1E），作者鉴定了 21 个神经元细胞类群和 10 个非神经元细胞类群。这些类群代表了已知构成 SC 的大多数主要细胞类型，包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞系细胞，以及内皮细胞和血管软脑膜细胞（Figures 1B and 1D）。

神经元约占所有已识别细胞的 77%，这与神经元细胞核有望在解离方案中存活的观点一致。在所有神经元细胞中，54% 是兴奋性神经元，46% 是抑制性神经元，但这一比例随时间点的不同而变化。E19 和 P4 的神经元大约有 60% 的兴奋性和 40% 的抑制性，而 P8 和 P21 的神经元大约有 46% 的兴奋性和 54% 的抑制性（Figure 1F）。这些观察结果与之前的研究一致，显示发育过程中兴奋性与抑制性神经元比例的变化。此外，与少突胶质细胞分化和髓鞘形成的时间一致，成熟 Mbp+ 少突胶质细胞谱系细胞的比例在 P8 和 P21 中高于 E19 和 P4。作者还观察到，非神经元细胞（例如小胶质细胞和星形胶质细胞）的比例随着时间的推移逐渐增加。总而言之，这些结果证实了之前对出生后早期发育过程中大脑细胞类型组成的研究，并进一步支持使用 snRNA-seq 研究 SC 细胞异质性。

3. SC 神经元在发育过程中的异质性

几项研究已经描述了成人 SC 神经元的分子不同类型，但仍然缺乏整个发育过程中的全基因组特征。由于神经元在作者的数据集中占相当大的比例，因此作者可以很好地提供 SC 神经元亚型之间转录异质性的参考图。为此，作者仅使用神经元进行嵌套聚类分析，以便仅考虑神经元之间不同表达的基因。这产生了 25 个神经元类群（Figures 2A and S2A），当投影到 UMAP（Figures 2A）上时，这些神经元类群主要按兴奋性或抑制性亚型进行分离，这一点通过基因 Slc17a6 的表达得到证实，该基因编码囊泡谷氨酸转运蛋白 VGlut2，或分别通过谷氨酸脱羧酶基因 GAD1 和 GAD2 的表达（Figures 2C and 2D）。因此，这些神经元类群被注释为 EN1-13 或 IN1-12 亚型。然后，作者根据数据来测量各个发育年龄的神经元亚型数量，发现大多数亚型在大多数时间点都被检测到（Figures 2B、S2B and S2C）。然而，EN1 和 IN1 亚型在较早的时间点 E19 和 P4 优先富集，并且许多亚型在较晚的时间点 P8 和 P21 按比例增加。在极端情况下，一些亚型受到时间限制，例如 EN7 亚型，仅在 E19 和 P4 阶段发现（Figure S2C）。

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(A) 通过神经元细胞聚类分析确定的神经元亚型的 UMAP。细胞按亚型着色。EN，兴奋性神经元亚型；IN，抑制性神经元亚型。\
(B) 按样本发育时间点着色的神经元 UMAP。\
(C) 按主要神经元类别着色的神经元 UMAP。\
(D) 与所有其他神经元组合相比，每种神经元亚型的 top DEGs 的点图。虚线划分了兴奋性和抑制性神经元亚型。点的大小表示每组中检测到基因的细胞百分比。点的颜色表示中心化和 z-scaled 对数归一化表达值。\
(E) 与 Allen Brain Atlas 中的 Egflam（左）、Gfra1（中）和 Nos1ap（右）进行原位杂交。基因是从 (D) 中显示的亚型 DEGs 列表中确定的（例如，Egflam 和 Gfra1）。\
(F) 显示 SC 的代表性冠状小鼠脑切片。使用针对 Gfra1（绿色）和 VGlut2（红色）的探针进行 FISH。比例尺，（E）和（F）（左侧两个面板）中为 500 μm，右侧面板中为 10 μm。
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随后的差异表达 (DE) 分析揭示了跨亚型的不同和重叠的标记基因（Figure 2D）。虽然某些神经元亚型可以通过单个基因的表达来唯一识别，例如 EN13 表达 Etv1，IN12 表达 Maf，但使用多个基因的组合可以更好地描述其他亚型，类似于之前对 SC 进行分类的研究中采用的方法。例如，EN7 亚型可以通过 Kitl 和 Slc18a6 的联合表达来确定，IN10 亚型可以通过 Ebf3 和 Gata3 的联合表达来确定。鉴于标记特异性的程度不同，作者接下来通过树状图分析量化了亚型表达谱的相似性（Figure S2D）。虽然作者的结果再次强调主要神经元类别（兴奋性与抑制性）是变异的最大来源，但作者也观察到某些神经元亚型（例如 EN1 和 IN1）与其他神经元亚型相比不太明显。作者通过计算按神经元类别分组的每个神经元亚型的 DEGs 数量证实了这一观察结果，并发现，事实上，EN1 和 IN1 亚型的 DEGs 数量最少，而其他更独特的亚型则具有超过 100 个 DEGs（Figures S2E 和 S2F）。

4. 兴奋亚型标记与 SC 层之间的相关性

先前的研究表明，形态学和生理学上不同类型的兴奋性 SC 神经元位于不同的层中，并有助于小鼠的各种行为反应。根据最初的 DE 分析，作者接下来对区分兴奋性亚型的标记基因进行了更详细的检查。在 13 种兴奋性神经元亚型中，作者发现了一些亚型表现出丰富的基因表达，这些基因已知可标记 SC 神经元亚群（Figure 2D）。EN13 亚型专门表达 Etv1，这是一种已知在 SO 层神经元亚群中表达的基因。Gfra1 在该亚型中也高度表达。之前的一项研究表明，Pitx2 定义了灰层中间层 (SGI) 中的兴奋性神经元亚群。作者发现，与其他兴奋性亚型相比，EN8 亚型表达的 Pitx2 和 Gli3 水平升高（Figure 2D and S8E）。因此，EN8 可能代表了先前表征的 SGI 细胞类型。其他具有显着基因富集的亚型是 EN12（其 Egflam 和 Tmem132c 表达富集）和 EN11（其 Nfib 和 Nfix 表达富集）。

考虑到 SC 神经元的拓扑排列，作者接下来检查这些神经元亚型是否位于成年 SC 的离散层中。在 Allen Brain 原位杂交数据库中，作者发现 Gfra1 在兴奋性神经元中表达，尤其是在 EN6 中表达量较高，在 SGS 中检测到的表达量较高，而在较深层中的表达量较低（Figures 2E and 2F）。Egflam 是 EN12 的一种标记物，主要在 SO 中检测到（Figure 2E）。Kitl 是在 EN5、EN6 和 EN7 中高表达的基因，主要在 SGS 中发现。同样，EN2 和 EN7 高度表达的 Tcf7l2 在 SGS 和 SO 中富集。为了验证这些标记基因在小鼠 SC 中的层特异性表达，作者对 Gfra1 和 Slc17a6（编码 VGlut2 的基因）进行了荧光原位杂交 (FISH)（Figure 2F）。在 SGS 层中，Gfra1 表达在 SC 内占主导地位，作者发现大约 90% 的 VGlut2+ 细胞与 Gfra1 共同标记，几乎所有 Gfra1+ 细胞与 VGlut2 共同标记。相反，在 SC 较深层（即 SGI）中，Gfra1+ 细胞数量较少，只有不到 10% 的 VGlut2+ 细胞与 Gfra1 共同标记。这些结果与作者的 snRNA-seq 数据一致，表明作者分析中确定的某些神经元亚型在特定层中富集。

5. 抑制性神经元亚型标记与 SC 层之间的相关性

与兴奋性神经元亚型一样，作者的聚类分析确定了 12 种具有不同转录特征的不同抑制性神经元亚型（Figure 2A），其中大多数亚型可以通过单个基因或基因组合来识别。例如，Spon1 是 IN6 特有的，Meis1 和 Gulp1 共表达是 IN7 特有的，IN11 亚型可以通过 Fibcd1 和 Pax7 的高表达来定义（Figure 2D）。作者检查了抑制性神经元亚型标记基因是否表现出 SC 层特异性，再次参考来自 Allen Brain Atlas 的原位杂交 (ISH) 数据。作者发现 Nos1ap（IN3 的标记物）主要在 SGS 中检测到（Figure 2E），Spon1（IN6 的标记物）在 SGS 和 SO 中富集（Figure 7K）。其他标记基因，如 Meis1，在 IN7 中高表达并在 SGS 和 SO 中检测到，在多个 SC 层中被发现。总而言之，这些数据表明聚类分析可以识别在 SC 层内具有特定解剖定位的转录上不同的神经元亚型。

6. 发育过程中神经元基因表达的变化

关键的神经发育过程，例如轴突生长、轴突靶向、视网膜定位图以及突触形成和成熟，需要转录因子和细胞粘附分子等基因产物的暂时调节表达。为了更好地理解这些动态，作者分析了不同时间段的 DEGs。对于兴奋性和抑制性神经元类别，Nnat、Nsg1、Nsg2、Fam171a2、Basp1、Pcsk1n 和 Rtn1 等基因在 E19 处富集（Figures 3A and 3B）。同样，转录因子 Tcf7l2（其基因产物在 Wnt 信号传导中起关键作用）在 P4 时在两个类别中均高度上调。通过基因功能 (GO) 分析对组合神经元基因表达变化的进一步表征表明，从 P4 到 P8，与 Wnt 信号传导相关的基因下调，支持了在此期间时间控制 Wnt 的重要性（Figures S3A and S3B）。有趣的是，作者观察到最大数量的神经元基因表达变化发生在 P8 和 P21 之间（Figure 3C），其中 P21 富含 Lncpint、Specc1、Rasgrf1、Naaladl2、Aifm3 和 Pcgf5 等基因。这一时期的明显变化可能反映了与突触成熟以及少突胶质细胞和髓鞘形成相关的神经元发育过程（Figure 1F）。事实上，作者对从 P8 到 P21 上调的基因的 GO 分析揭示了诸如“突触可塑性调节”和“突触小泡胞吐作用”等术语（Figure S3B）。总体而言，兴奋性和抑制性神经元都表现出相似的转录活动时间模式，其通过 GO 分析推断的生物学功能概括了已知的发育里程碑。

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(A and B) 在 (A) 兴奋性神经元或 (B) 抑制性神经元中每个发育时间点的 top DEGs 热图。在 DE 测试之前，兴奋性或抑制性神经元亚型被聚集。\
(C) 量化连续发育时间点之间上调或下调的 DEGs 数量。\
(D) Allen Brain Atlas 中 Zic1 的原位杂交。\
(E) Allen Brain Atlas 中 Lef1 的原位杂交。Wilcoxon 秩和检验，在 Seurat 的 FindMarkers() 函数中实现。比例尺，500 μm。
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对 Allen Brain 原位数据的检查表明，一些基因在空间和时间上都受到调节。例如，兴奋性神经元在 P4 时表现出转录 Zic1 的高表达。原位数据显示，在 E18.5 和 P4 时，Zic1 表达仅在 SGI 层 SC 的内侧较高，而在外侧不存在（Figure 3D，顶部三个图）。到成年期（即 P56），不再检测到 SC 中的内侧特异性 Zic1 表达（Figure 3D，下图）。这种表达模式表明 Zic1 可能决定该区域沿外侧-内侧轴的轴突方向性（参见讨论）。同样，转录因子 Lef1 在 P8 处高度表达，除了丘脑区域外，几乎只在 SC 中检测到（Figure 3E）。这些数据支持神经元基因表达变化是时空调节的观点。

有了这些发现，作者接下来询问是否可以在亚型水平而不是在主要神经元类别水平上识别发育调节的基因表达程序。为了解决这个问题，作者使用 Monocle3 进行轨迹分析（参见 STAR Methods）。作者的结果揭示了从中央“节点”分支的几条轨迹，其中具有最早预测拟时序的细胞富含神经元亚型 EN1 和 IN1，这在 E19 和 P4 中最常见（Figures S4A and S4C）。此外，作者观察到，在稍后的时间点 P8 和 P21 收集的细胞也富集了沿着拟时序进展的细胞（Figure S4B）。

通过这些轨迹，作者识别出了 9,725 个作为拟时序函数而不同的基因。然后，作者将这些基因聚类成模块，随后发现一个基因模块特定于从 IN1 到 IN8、从 IN8 到 IN4 的轨迹（Figure S4D）。该模块中具有显着统计学意义的基因包括 Epyc、Il1rapl2、Kcnip1、Pax7、Pax3 和 Ptprt（Figure S4E）。有趣的是，尽管 Pax7 的表达量沿着轨迹进一步增加，但 Pax3 在轨迹早期短暂检测到，并且与 Pax7 相反，这与先前的研究一致，证明这两种转录因子在发育过程中表达模式存在差异。这些结果呈现出潜在的 IN1-IN8-IN4 发育轨迹可能由 Pax7 和 Pax3 等转录因子介导。

7. 发育过程中神经胶质基因表达的变化

除了神经元之外，作者还成功捕获了几乎所有神经胶质细胞，其中星形胶质细胞最为丰富。对整个发育时间点的星形胶质细胞基因表达的比较（Figure S5A）揭示了轴突引导分子基因（例如 Ephb1、Robo1 和 Ephb2）在 E19 时的富集，以及它们的表达随着时间的推移而下降。此外，P4 星形胶质细胞高度表达 Hs6st3，这是一种硫酸乙酰肝素 (HS) 磺基转移酶，已知可以修饰 HS 并调节粘附。P8 星形胶质细胞富含 Ptchd4（典型刺猬信号传导的阻遏物）和谷氨酸代谢型受体 Grm7。与神经元一样，星形胶质细胞也表现出 P8 和 P21 之间 DEG 数量的大幅增加（Figure S5B）。其中包括 Gja1 和 Gjb6 等基因，分别编码间隙连接蛋白，也称为 Connexin-30 和 Connexin-43，对应 GO 术语“细胞连接组装”（GO：0034329）。这些基因与星形胶质细胞突触覆盖有关。对星形胶质细胞功能很重要的其他基因，例如编码离子通道和离子通道调节因子的基因（例如 Trpm3 和 Lgi1）以及磷脂酶（例如 Plcb1 和 Gpld1），在P21。这些结果共同表明，星形胶质细胞可能在出生后发育早期的轴突引导中发挥作用，并重申了它们在青年期突触细化中的作用，同时 P21 出现了成熟的 Mbp+ 少突胶质细胞谱系细胞。

少突胶质细胞谱系细胞显示 UMAP 坐标，提示发育过程中的分化（Figure 1B）。与这一观察结果一致，作者的 DE 分析显示少突胶质细胞祖细胞 (OPC) 标记基因（例如 E19 处的 Olig1 和 Pdgfra）富集，并且其产物编码髓鞘成分的基因，例如 Mag、Plp1、 Mbp 和 Mog，位于 P21（Figure S5C）。此外，作者观察到 Sox6 表达从 E19 到 P8 保持高水平，但在 P21 时下调。这与 Sox6 维持少突胶质细胞的前体状态，从而确保 CNS 中髓鞘形成的正确时间的观点一致。其他基因显示出类似的表达模式，例如 Lrrtm4 和磷酸二酯酶 Pde4d。总的来说，对于其他细胞类型，作者观察到与其他时间点相比，P8 和 P21 之间差异表达的基因要多得多，这再次表明这个关键时期是高度转录动态的（Figure S5D）。

尽管作者成功识别了小胶质细胞类群，但它们总共有 90 个细胞核，降低了识别 DEG 的能力。因此，他们的分析未包含在本报告中。

8. 主要轴突引导分子的综合评估

Cadherins 和 protocadherins

钙粘蛋白和原钙粘蛋白在轴突引导和目标选择中发挥重要作用。在钙粘蛋白家族成员中，作者发现 Cdh8、Cdh12、Cdh13 和 Cdh18 在神经元中的表达特别高，在非神经元细胞中表达较低（Figure 4A）。相比之下，作者观察到特定钙粘蛋白基因在非神经元细胞中的显着表达；Cdh20 表达在星形胶质细胞中异常高，而 Cdh1 表达是上皮细胞特有的。作者发现 Pcdh9 和 Pcdh15 在少突胶质细胞系细胞中高表达。值得注意的是，Pcdh10 和 Pcdh15 在兴奋性神经元中的表达水平高于抑制性神经元。另一方面，抑制性神经元中的 Pcdh7 表达较高（Figure 4A）。在作者的分析过程中，作者注意到，虽然大多数钙粘蛋白和原钙粘蛋白在兴奋性和抑制性神经元中作为一类以相似的水平表达，但它们的表达在亚型水平上差异很大。由于选择性钙粘蛋白表达已被证明可以促进神经元类别特异性细胞粘附和突触连接，作者生成了跨神经元亚型的钙粘蛋白和原钙粘蛋白家族基因表达的综合面板（Figure 4B and S6）。从该图中，作者发现 Cdh7 在兴奋性神经元亚群（EN5 和 EN6）中表达水平较高。此前，Byun et al. 描述了 Cdh7 作为上层 SGS (uSGS) 神经元亚群的标记。作者扩展了这一发现，表明 Cdh7 是上层 SGS 兴奋性神经元的标记。作者用双色 FISH 进一步验证了这一结果（Figure 4C），其显示 Cdh7 表达主要在 VGlut2+ 细胞中。相反，作者发现与兴奋性群体相比，Cdh12 和 Cdh22（Figures 4A and 4D）优先富集于抑制性亚型。

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(A) 钙粘蛋白和原钙粘蛋白家族基因在 SC 细胞类型中的 scaled 基因表达值的点图。仅显示在至少 0.1% 的所有细胞中检测到的基因。对于所有点图，点的大小表示每组中检测到基因的细胞的百分比。点的颜色表示中心化和 z-scaled 对数归一化表达值。\
(B) 钙粘蛋白和原钙粘蛋白家族基因在 SC 神经元亚型中的 scaled 基因表达值的点图。仅显示在至少 0.1% 的所有神经元细胞中检测到的基因。星号表示与所有其他细胞的总和相比，每个组中每个基因的统计显著富集。Seurat 的 FindMarkers() 函数中实施的 Wilcoxon 秩和检验。FDR，错误发现率。\
(C) 针对 SC 中的 Cdh7（黄色）的双色 FISH，该基因在 EN6 和 EN7 亚型中富集，以及兴奋性神经元标记 VGlut2（绿色）。右侧面板，中间面板中方框区域的放大率更高。\
(D) 针对 SC 中的 Cdh22（黄色）的双色 FISH，该基因富含几种抑制性神经元亚型，以及抑制性神经元标记物 GAD2（绿色）。右图，中间图中方框区域的放大倍数较高。箭头表示似乎同时表达 Cdh22 和 GAD2 的细胞。比例尺，15 μm。
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Eph 受体和 ephrins

该受体和配体家族是参与视网膜小球地形图绘制的关键信号分子。因此，除了 Epha1、Epha2、Ephb3 和 Ephb4 之外，许多 Eph 受体在多个时间点的 SC 神经元中都被高度检测到（Figure S7A）。还检测到多种 ephrin 配体，其中一些配体，例如 Efna2 和 Efnb3，随着时间的推移在神经元中表现出下调。总体而言，作者观察到与非神经元细胞相比，Eph 受体和 ephrin 家族的基因主要在神经元中表达。一些例外包括 Epha5、Ephb1 和 Ephb2 的星形胶质细胞表达（随着时间的推移显着下降）以及少突胶质细胞谱系细胞的 Efnb3 表达。

Semaphorins 和 plexins

这些分子调节与细胞形态和通讯相关的功能，有助于轴突引导。在作者的数据中，大多数 semaphorin-plexin 家族基因在所有时间点的 SC 神经元中均被检测到，例如 Plxna4、Sema4f 和 Sema4g（Figure S7A）。尽管神经元中大多数基因的表达水平保持恒定，但 Sema3f 和 Plxna1 在整个发育时间点上表现出显着下降。然而，非神经元细胞也表达 semaphorin-plexin 家族的成员。例如，随着时间的推移，星形胶质细胞表现出 Plxnb1 的丰富表达和 Sema4b 的强烈上调，少突胶质细胞谱系细胞在 Plxnb3、Sema4d 和 Sema6d 中表现出类似的强烈时间变化。

Robo 受体和 Slit

虽然几乎在所有细胞群中都检测到了 Robo1 和 Robo2 的转录本，但这些基因在 SC 神经元中表达最高（Figure S7A）。相比之下，Robo3 在所有时间点的所有细胞类型中均检测到低水平，但兴奋性神经元除外，兴奋性神经元的表达在各个时间点显着增加。对 Robo3 的进一步检查表明，其表达仅限于神经元亚型 EN5 和 EN6，这些亚型的比例随着时间的推移而相应增加。有趣的是，这些相同的 Robo3+ 亚型包含 Gfra1+ 神经元的子集。双色 FISH 显示 Gfra1+ 细胞中 Robo3 表达，进一步证实了作者的测序结果（Figure S7B）。相反，虽然 Robo 配体 Slit2 和 Slit3 在上皮细胞中检测得最多，并且仅在 SC 神经元中适度表达，但 Slit1 几乎完全由神经元表达（Figure S7A）。鉴于 SLIT-ROBO 通路在引导 RGC 轴突通过视交叉到达大脑中的作用，作者还从 Broad Institute 的单细胞门户查询了小鼠 RGC scRNA-seq 数据。作者发现 Robo1 在一些 RGC 类群中表达特别高，而 Robo2 在所有 RGC 亚型中表达高且一致。另一方面，Robo3 的检测水平较低。总之，这些数据表明多种细胞类型，包括 SC 的特定神经元亚型，可能影响轴突对 SC 的靶向和神经支配。

9. 神经元亚型与已发表的 SC scRNA-seq 数据之间的对应关系

最近的几项研究使用 scRNA-seq 或 snRNA-seq 分析了小鼠 SC 神经元。其中两项研究巧妙地利用跨突触和逆行腺相关病毒 (AAV) 分别专门分析视网膜受体神经元和 SC 投射神经元。Tsai et al. 开发了 Trans-seq 方法，该方法使用改良的 AAV-wheat germ agglutinin (WGA) 来识别和分析 RGCs 突触后的 SC 神经元。Cheung et al. 使用逆行病毒开发了病毒编码的连接转基因覆盖 RNA 测序 (Vector-seq)，以分析将轴突发送到不同大脑区域的 SC 投射神经元。2021 年，Xie et al. 对成年小鼠 SC 进行了 snRNA-seq，并开发了一种称为 mRNA 表达数据空间分类 (SPACED) 的信息学工具，用于计算研究中确定的神经元亚型的层特异性概率。在所有研究中，作者提供了新颖的用户定义的 SC 神经元的亚型。这些亚型如何在研究中进行比较尚不清楚，也不清楚这些类群是否在作者的发育时间过程数据集中被检测到。

为了阐明 SC 神经元亚型的统一分子定义，作者从每项研究中提取数据，并首先询问是否在这些已发表的数据中检测到作者研究中定义的神经元亚型。为此，作者应用了 SingleR 分类算法（Figure 5A），使用作者研究中的 snRNA-seq 数据作为参考，并将这些先前数据集的数据作为查询集。简而言之，SingleR 算法计算参考数据亚型标记基因子集（即 EN1-13 和 IN1-12 亚型标记基因）的查询数据细胞和参考数据细胞之间的 Spearman 相关性。每个子类型的得分是根据这些相关性确定的，得分最高的子类型将成为预测的子类型（有关更多详细信息，请参阅 STAR Methods）。考虑到测序深度和解离方法、研究相关批次效应以及环境 RNA 污染驱动的技术噪音方面的差异，该方法特别适合这种分析。

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(A) SingleR 方法示意图，该方法使用作者在分析中定义的神经元亚型的标记基因对来自已发表数据源的神经元进行分类。简而言之，对于每个查询细胞，SingleR 计算其表达谱与每个参考标签（即作者的亚型）的平均表达谱之间的相关性。每个标签相关性上分位数的查询细胞被注释为该标签。\
(B and D) (B) 来自 Trans-seq 数据的细胞的 UMAP（参见 Tsai et al. 的 Figure 5B）或 (D) Vector-seq 数据（参见 Cheung et al. 的 Figure 3B）按预测分类着色。\
(C and E) (C) 当前分析中确定的神经元亚型与 Tsai et al. 在 Trans-seq 中确定的 clusters 或 (E) Cheung et al. 在 Vector-seq 中确定的 clusters 之间的对应关系热图。热图值描绘了 y 轴 clusters 中被注释为 x 轴神经元亚型的细胞比例；例如，Vector-seq 中 cluster 18 中的 99% 的细胞根据 IN5 的标记基因被归类为 IN5。沿行求和等于 100。\
(F and G) 兴奋性和抑制性神经元亚型中 Gpc3 (F) 和 Sntb1 (G) 表达的小提琴图。Xie et al. 的Clusters Ex-6（即 Gpc3+ 神经元）和 Ex-8（即 Sntb+ 神经元）分别对应于作者的 EN12 和 EN6。
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最初的 Trans-seq 研究将视网膜受体 SC 神经元分为三种兴奋性亚型 (ESC1-3) 和五种抑制性亚型 (ISC1-5)。 为了将这些亚型与作者研究中的亚型进行比较，作者应用了 SingleR 并计算了预测的比例包含每个 Trans-seq 亚型的标签（Figures 5B and 5C）。作者的分析表明，Trans-seq ISC1 和 ISC2 亚型中分别超过 93% 和 97% 的细胞被预测为作者的抑制亚型 IN3。这表明这三个群体之间存在高度相似性，并且 IN3 可能是视网膜受体群体。相反，只有兴奋性神经元亚型 EN5、EN6、EN9 和 EN12 的预测占所有 Trans-seq 亚型的 10% 以上。这符合视网膜受体神经元仅包含所有 SC 神经元的一个子集的预期，并进一步表明 RGC 仅以亚型特异性方式投射到 SC 神经元上。总体而言，五种神经元亚型（IN3、IN9、EN12、IN4 和 EN5）约占 Trans-seq 数据集中预测亚型的 75%（Figure 6A），表明这些亚型可能代表最有可能的 RGC 突触后输入候选者。

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(A) 所分析的三个数据集中 SingleR 神经元亚型预测的堆积条形图。y 轴表示已发表的研究。\
(B) 从当前研究、Tsai 等人的研究 (Trans-seq) 和 Cheung 等人的研究 (Vector-seq) 中收集的 SC 神经元的 UMAP。请注意，当前研究中的细胞和 Cheung 等人的细胞有大量重叠。\
(C) 与 (B) 相同的 UMAP，但仅显示来自当前研究的细胞。细胞按神经元亚型着色。\
(D) 与 (B) 相同的 UMAP，但细胞按来源研究分开。\
(E) 从先前对 SC 神经元的研究中确定的常见标记基因的跨神经元亚型表达点图。点的大小表示每组中检测到基因的细胞百分比。点的颜色表示中心化和 z-scaled 对数归一化表达值。
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Cheung 等人的 Vector-seq 研究。使用 snRNA-seq 分析了 SC 的约 55,000 个核。当作者对这些数据应用相同的 SingleR 方法时，作者发现神经元亚型和 Vector-seq 类群之间具有很强的一致性。在 35 个 Vector-seq 类群中，13 个类群中超过 90% 的细胞预计属于作者研究中定义的单一神经元亚型，而 20 个类群中超过 70% 的细胞属于单一亚型（Figures 5D and 5E）。值得注意的是，Cheung 等人使用他们的逆行标记策略。报道称，大约 1,500 个 Vector-seq 兴奋性神经元（clusters 2 和 7，来自 Cheung 等人的 Figure 3C）是投射到对侧旁正中脑桥网状结构 (PPRF) 的 SC 神经元（即已知控制定向运动的 SC 神经元），大约 3,100 个细胞是 SC 神经元（clusters 10 和 11，来自 Cheung 等人的 Figure 3C）投射到丘脑外侧后核（LP）。作者仅对兴奋性神经元重复进行 SingleR 分析，发现 Vector-seq 兴奋性神经元 cluster 7 与作者的兴奋性亚型 Pitx2+ EN8 高度一致，表明 EN8 可能代表投射到 PPRF 的 SC 神经元（Figures S8A, S8B, and S8E）。此外，Vector-seq 兴奋性神经元 cluster 10 为 Ntng2+，主要由 Ntng2+ 兴奋性亚型 EN3 组成，而 Vector-seq 兴奋性神经元 cluster 11 由 EN2 和 EN12 的组合组成，可以通过 Cbln2 来区分（Figures S8C and S8D）。由此，作者推测 EN3、EN2 和 EN12 亚型是投射到丘脑 LP 的 SC 神经元。

最后，作者将 SingleR 应用于 Xie 等人的成人 SC 的 scRNA-seq 数据。使用这些数据，作者对神经元细胞进行聚类，并计算它们与作者研究中确定的神经元亚型的一致性。作者发现 22 个类群中的 14 个类群的预测亚型组成中超过 75% 属于单个神经元亚型（Figures S8F and S8G），这表明两项研究中评估的亚型异质性之间具有高度一致性。当将标记基因与 Xie 等人鉴定的小鼠 SC snRNA-seq 类群进行比较时（与 SingleR 分析中比较的类群不同；有关详细信息，请参阅 STAR Methods），作者再次发现两项研究之间存在良好的对应关系。例如，来自 Xie 等人的 Ex-6（即 Gpc3+ 神经元）和 Ex-8（即 Sntb+ 神经元）类群。分别对应于作者的 EN12 和 EN6（Figures 5F and 5G）。

虽然 SingleR 方法允许将细胞身份从参考数据集映射到未标记的查询数据集，但对所有研究中的细胞进行直接整合分析将允许更全面地了解 SC 神经元异质性。因此，作者整合了 Cheung 等人、Tsai 等人以及当前使用 Seurat 进行的研究的神经元，并检查了亚型分布和重叠。作者的结果表明，作者的分析类群中识别出的大多数神经元亚型与 Cheung 等人识别的神经元类群一起。使用 Vector-seq（Figures 6B、6C and 6D）。值得注意的是，Tsai 等人使用 Trans-seq 分离视网膜受体 SC 神经元。有趣的是，Tsai 等人提出了 ISC1 和 ISC2 亚型。根据作者的分析，它们与 IN3 聚类，以及 Cheung 等人的 cluster 4，表明这些抑制性神经元可能是视网膜投射的接受者。

Byun 等人利用原位杂交和免疫染色证明，几种分子标记可对 10 种浅表 SC (sSC) 神经元类型进行分类，包括基因 Rorβ 和 Etv1。如前所述，作者发现 Etv1 表达是 EN13 所独有的。在作者的研究中，来自兴奋性和抑制性群体的几种亚型都表达 Rorβ，尽管这种表达在兴奋性神经元类群中更为广泛（Figure 6E）。另一方面，作者发现 Etv1 表达是 EN13 所独有的。

先前的研究还将小鼠中的抑制性 SC 细胞分为三个不重叠的类别；那些表达 Sst、Vip 或 Pvalb 的。Pvalb+ 神经元存在于下部 SGS 和 SO，支配丘脑的 LP。因此，一些 Pvalb+ 神经元是投射神经元，而不是中间神经元。虽然 Pvalb 标记了大脑皮层、纹状体和海马中 GABA 能快速尖峰抑制性中间神经元的特定亚类，结果表明，sSC 中的 Pvalb+ 神经元呈现出异质的尖峰分布和形态，并且只有一小部分含有 GABA。另一方面，SC 中间层中较高比例的 Pvalb+ 群体显示出 GABA 的存在。与 SC 中的 Pvalb+ 神经元可能是谷氨酸能和 GABA 能神经元的异质群体的观点一致，作者观察到多个神经元亚型中 Pvalb 的水平较低但可检测到（Figure 6E）。相反，作者发现 Sst 和 Vip 标记了特定的亚型；Sst+神经元对应于 IN4、IN8 和 IN12 亚型，而 Vip+ 神经元对应于 IN9 亚型。

10. GABA 能神经元亚群的表征：表达 Pax7 的神经元

SGS 含有高密度的 GABA 能神经元；该区域 30% 的神经元为 GABA 能神经元，视网膜顶盖末梢约三分之一的突触后目标为 GABA 能神经元。GABA 能 SC 神经元及其与其他大脑区域的连接已被证明在觉醒中发挥着关键作用。然而，GABAergic SC 环路的发育和功能组织仍在研究中。基于轴突投射、树突乔木方向和/或多种免疫细胞化学标记物的共定位，已经描述了几种 GABA 能 SC 细胞类型。在作者的分析中，作者将 Pax7 鉴定为 GABA 能神经元选择性标记，在 IN2、IN4、IN6、IN9、IN11 和 IN12 亚型中检测到（Figures 7A and 7B）。Pax7 是一种转录因子，已知可引导胚胎细胞沿着神经源性谱系并形成 SC 边界。根据 Allen Brain ISH 数据库，在成年小鼠大脑中，Pax7 表达在 sSC 中最高（Figures 7C and 7D）。为了研究 SC 中 Pax7+ GABA 能神经元的组织，作者将 AAV-FLEX-GFP 注射到成年 Pax7-Cre 小鼠的 sSC 中，其中 GFP 表达仅限于表达 Pax7 的细胞。值得注意的是，与 Rosa26-Tomato 报告小鼠杂交的 Pax7-Cre 小鼠显示 tdTomato 表达主要在中脑，而不是在皮质中（Figure 7E），这与 Allen Brain Atlas 中显示的 Pax7 表达模式一致（Figure 7C）。有趣的是，作者在腹侧 LGN (vLGN) 中发现了 GFP+ 轴突末端，但在 LP、副二联核 (PBg) 或背侧 LGN (dLGN) 中没有发现（Figure 7F-7H）。另一方面，Gale 等人使用 GAD2-Cre 小鼠选择性标记 sSC 中的抑制性神经元，并在几个细胞核中展示轴突末端，包括 PBg、dLGN 的背外侧部分和 vLGN。这表明只有某些抑制性神经元是 Pax7+，如作者的聚类分析所示。接下来，作者进行双色 FISH 以确定 Pax7 是否可以与第二种抑制性神经元亚型标记共定位，并研究 Pax7+ 神经元是否由多种抑制性亚型组成。在本实验中，作者选择了 Spon1（用于 IN6）和 Fibcd1（用于 IN11），因为根据 Allen Brain Atlas，它们在 SGS 中富集。作者的研究结果证实，Spon1 和 Fibcd1 在 Pax7+ 细胞中表达，并且确实定位于 SGS 层（Figure 7I and 7J）。作者根据 Allen Brain Atlas 的 ISH 数据进一步证实了这些结果（Figure 7K and 7L）。总之，这些结果表明 Pax7 标记了 GABA 能 SC 神经元的异质群体，该群体由至少两种转录上不同的亚型组成，并具有远程投射到 vLGN。

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(A) Pax7 在兴奋性和抑制性神经元亚型中表达的小提琴图表明，Pax7 的检测仅限于抑制性神经元的一个子集。\
(B) 左图：SC 神经元中 Pax7 表达的 UMAP。右图：在收集的四个发育时间点的 SC 神经元中 Pax7 表达的 UMAP。\
(C) 与 Allen Brain Atlas 中的 Pax7 进行原位杂交。Pax7 表达仅限于中脑。\
(D) (C) 中 SC 的更高放大倍数。\
(E) Pax7-Cre；Rosa26-tdTomato 双转基因小鼠的大脑冠状切片中的 tdTomato 表达。与原位杂交 (C) 一致，tdTomato 表达仅限于中脑。\
(F–H) SC (F)、LGN (G) 和 PBg (H) 中的 GFP 表达。白色虚线区域表示相应的细胞核。成年 Pax7-Cre；Rosa26-tdTomato 的 sSC 中注射了 AAV2-FLEX-GFP。\
(I) 成年 SC 中 Spon1 和 Pax7 的双色 FISH。箭头表示似乎表达这两种基因的细胞。\
(J) 成年 SC 中 Fibcd1 和 Pax7 的双色 FISH。箭头表示似乎表达这两种基因的细胞。\
(K) Allen Brain Atlas 中 Spon1 的 SC ISH 图像。\
(L) Allen Brain Atlas 中 Fibcd1 的 SC ISH 图像。比例尺，15 μm（I 和 J）。比例尺，500 μm（C–H、K 和 L）。
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讨论

SC 是多感官整合的区域，也是研究环路形成的新兴模型。在 SC 发育过程中，不同的转录因子、细胞粘附分子和细胞外基质蛋白有助于轴突引导和正确神经环路的形成。在作者的分析中，作者确定 Zic1 是一种具有严格的空间和时间发育调节的转录因子（Figure 3D）。人们早就知道锌指转录因子 Zic 家族的成员调节轴突引导分子的表达，并在中枢神经系统的轴突靶向中发挥关键作用。例如，Zic2 控制视网膜中特定 RGC 群体中 EphB1 受体的表达，进而促进这些神经元向同侧大脑一侧投射。根据作者的发现，人们可能会假设 Zic1 在引导传入轴突方面发挥着作用。到 SC 的适当区域。作者的分析还鉴定了粘附分子基因 Cdh22，作者发现该基因对抑制性神经元具有特异性。先前的研究表明，某些钙粘蛋白成员在中间神经元中具有特异性功能，特别是在抑制性突触中；Cdh13 缺陷被证明会减少突触周转，从而增加抑制性突触密度。Cdh22 可能发挥类似的作用，并调节 SC 中的中间神经元发育和突触功能。

最近的研究表明，神经胶质细胞表达的轴突引导分子在中枢神经系统回路的形成和成熟中也发挥着关键作用。例如，星形胶质细胞已被证明可以分泌多种生长因子和细胞外基质蛋白，调节轴突生长的方向和突触形成的程度。支持这一观点的是，作者的数据显示了各种引导分子的星形胶质细胞表达随时间的动态变化点；虽然编码 Eph 受体和肝配蛋白分子的基因随着时间的推移表现出表达减少，但来自 semaphorin-plexin 信号通路的基因子集（例如 Sema4a 和 Sema4b）的表达增加。需要进一步的功能研究来剖析星形胶质细胞在 SC 环路成熟中的精确作用。

SC 包含异质的 GABA 能神经元群，其特性和神经支配在丘脑功能的调节中起着关键作用。作者发现 Pax7 转录物在抑制性神经元亚型的亚群中富集（即 SC 中大约一半的抑制性神经元）。通过标记 sSC 中 Pax7+ 神经元的轴突，作者发现这些神经元专门向 vLGN 发送长投射，而不向其他已知的远端目标（例如 LP、dLGN 和 PBg）发送长投射。vLGN 被认为是一部分多模态系统的一部分，接收视网膜传入信号，但与非成像区域（例如，橄榄体顶盖前核、附件视觉系统和视交叉上核）。vLGN 还投射到 SC、导水管周围灰区 (PAG) 和腹侧中线丘脑的团聚核。这些区域都有助于对视觉威胁的行为反应。Pax7+ sSC 神经元是否是功能独特的细胞群，有助于视觉引导行为或非图像形成视觉功能，目前仍不清楚。

总之，本报告提供了构成小鼠发育过程中 SC 的细胞类型的全面分子特征，特别强调神经元异质性和参与环路组装的分子。通过比较 Allen 脑图谱的原位杂交数据，作者证明某些转录定义的神经元亚型也表现出解剖特异性。作者还尝试在多项研究中提供 SC 神经元亚型的统一定义，并推断不同大脑区域的亚型特异性预测。最后，通过利用作者的 snRNA-seq 数据，作者确认并表征了 SC 神经元 Pax7+ 子集的预测，以证明这些数据作为特定神经元群体和回路操作起点的实用性。为此，作者提供了一个用于探索这些数据的门户网站：https://parklabmiami.shinyapps.io/superior-colliculus-snRNAseq/。

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