RNA-seq 差异分析的细节详解 (7)

引言

本系列 将开展全新的转录组分析专栏，主要针对使用 DESeq2 时可能出现的问题和方法进行展开描述。想要学习更多内容可以添加文末的学习交流群或客服QQ。

在任何数据分析中，评估数据质量并进行质量控制（也就是剔除质量不达标的那部分数据）是关键环节。一般而言，这些环节应在开始分析新数据集时尽早开展，要么是在差异表达测试之前，要么是与之同步进行。

我们所说的“质量”，是指数据是否符合我们的研究目的。我们的研究目标是找出差异表达的基因，尤其关注那些因实验处理过程中出现异常情况，导致从这些样本中获取的数据对我们研究目的产生负面影响的样本。

计数矩阵的热图展示

要深入了解计数矩阵，将其以热图的形式呈现往往能带来不少洞见。接下来，我们会介绍如何针对数据的不同转换方式来制作相应的热图。

library("pheatmap")
select <- order(rowMeans(counts(dds,normalized=TRUE)),
                decreasing=TRUE)[1:20]
df <- as.data.frame(colData(dds)[,c("condition","type")])
pheatmap(assay(ntd)[select,], cluster_rows=FALSE, show_rownames=FALSE,
         cluster_cols=FALSE, annotation_col=df)

pheatmap(assay(vsd)[select,], cluster_rows=FALSE, show_rownames=FALSE,
         cluster_cols=FALSE, annotation_col=df)

pheatmap(assay(rld)[select,], cluster_rows=FALSE, show_rownames=FALSE,
         cluster_cols=FALSE, annotation_col=df)

样本间距离的热图展示

转换后的数据还可以用于进行样本聚类分析。具体操作是，把 dist 函数用在转换后计数矩阵的转置上，从而计算出各样本之间的距离。

sampleDists <- dist(t(assay(vsd)))

通过绘制该距离矩阵的热图，我们可以直观地了解不同样本间的相似之处与差异所在。在使用热图函数时，需要依据样本间的距离来提供一个层次聚类 hc，若不这么做，热图函数就会依据距离矩阵中行与列之间的距离自行进行聚类分析。

library("RColorBrewer")
sampleDistMatrix <- as.matrix(sampleDists)
rownames(sampleDistMatrix) <- paste(vsd$condition, vsd$type, sep="-")
colnames(sampleDistMatrix) <- NULL
colors <- colorRampPalette( rev(brewer.pal(9, "Blues")) )(255)
pheatmap(sampleDistMatrix,
         clustering_distance_rows=sampleDists,
         clustering_distance_cols=sampleDists,
         col=colors)

样本主成分分析图的绘制

与距离矩阵紧密相连的是主成分分析（PCA）图，它将样本映射在由前两个主成分构成的二维平面上。利用这种图表，我们可以直观地观察实验协变量以及批次效应所产生的整体影响。

plotPCA(vsd, intgroup=c("condition", "type"))

还可以使用 ggplot 函数自定义 PCA 图。

pcaData <- plotPCA(vsd, intgroup=c("condition", "type"), returnData=TRUE)
percentVar <- round(100 * attr(pcaData, "percentVar"))
ggplot(pcaData, aes(PC1, PC2, color=condition, shape=type)) +
  geom_point(size=3) +
  xlab(paste0("PC1: ",percentVar[1],"% variance")) +
  ylab(paste0("PC2: ",percentVar[2],"% variance")) + 
  coord_fixed()

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