文献阅读 | Nature Communications | 单细胞表观基因组学和时空转录组学揭示了人的小脑发育

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文献介绍

文献题目： 单细胞表观基因组学和时空转录组学揭示了人的小脑发育 \
研究团队： 吴倩（北京师范大学）、钟穗娟（北京师范大学）\
发表时间： 2023-11-22 \
发表期刊： Nature Communications \
影响因子： 16.6（2023年）\
DOI： 10.1038/s41467-023-43568-6
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摘要

人类小脑发育由分子调节网络精心策划，以实现细胞结构并协调运动和认知功能。在这里，作者结合了单细胞转录组学，空间转录组学和单细胞染色质可及性状态，并系统地描绘了人类胎儿小脑发育的综合时空景观。作者揭示了转录因子和顺式调节元件（CREs）的组合在祖细胞分化和细胞命运沿轨迹的测定中以层次结构方式起着作用，为这些细胞提供了细胞命运和空间信息的基因表达调节图。作者还表明，位于小脑皮质不同区域中的颗粒细胞在发育过程中显示出由不同信号调节的不同信号的不同分子特征。最后，作者映射了与小脑功能障碍有关的疾病的单核苷酸多态性（SNPs），发现几个疾病相关的基因仅在人类中显示出时空和细胞类型特异性的表达模式，表明细胞基础和可能的神经精神疾病病原体的机制。

前言

小脑是一种中央神经结构，由两个半球组成，由小脑蚓连接。它源自最前后后脑的背侧部分，位于髓质长方形上方。小脑在经典上是在运动控制中发挥作用的，现在被认为通过与大脑皮层的连接来促进许多认知功能。影响小脑的损伤或疾病通常与脊髓脑性共济失调，先天性小脑低调，智力残疾，自闭症谱系障碍（ASD），髓母细胞瘤，髓母细胞瘤等有关。

在 apes 的整个演变中，实际的小脑大小比新皮层的扩张速度快。小脑仅占脑部质量的 10％，其中包含所有脑神经元的 80％。人小脑中产生大量神经元是一个关键问题。小脑神经祖细胞位于不同的壁龛，经历了编程的扩散，分化和迁移，最终构建了一个功能性小脑。祖细胞和神经元的空间组织对于小脑发育和功能至关重要。在发育中的人小脑中，菱形唇（RL）祖细胞和心室区（VZ）祖细胞分别引起谷氨酸能细胞（大多数是颗粒细胞）和 GABA 能神经元。产生 GABA 能神经元后，VZ 祖细胞负责神经胶质发生。在小脑中，空间位置对于神经元连接和功能也是必不可少的。例如，在发育过程中浦肯野细胞的不同亚型位于不同的区域，而浦肯野细胞分为不同的隔室，在成熟小脑中具有不同的神经环路。最近的研究揭示了人小脑祖细胞的多样性和分子特征以及小脑的进化差异。尽管已经说明了 VZ 和 SVZ RL 祖细胞的分子特征，并与髓母细胞瘤的起源有关，但在人类小脑发育过程中，全局空间基因表达模式和表观遗传信息在单细胞水平上尚未全面报道。染色质可及性状态作为表观遗传特征揭示了顺式调节元件的活性，这些元素在控制时空和细胞类型特异性基因表达模式中起着重要作用。对染色质可及性状态的研究不仅使我们能够揭示控制人小脑发育和细胞分化的基因的调节程序，而且还可能说明了物种之间的进化差异，并有助于解释非编码 DNA 区域的突变与人类疾病有关。在这里，作者结合了单细胞染色质可及性状态，空间转录组和单细胞转录组，系统地描绘了分子特征的整合空间景观以及覆盖 GW 12-27 的发育中的人小脑的细胞组成。多组学数据描述了一种全面的人类胎儿小脑空间发育蓝图，该蓝图整合了细胞类型多样性的空间信息和动态，以及在转录组和表观遗传学水平上确定神经元和神经胶质细胞命运确定的分子调节，从而完善了我们对人类小脑发育和相关疾病的知识。

研究结果

1. 人类胎儿小脑的细胞类型多样性

为了研究小脑发育过程中细胞类型特异性基因表达模式和调节动力学，作者通过 scATACseq 和 scRNAseq 构建了整个左小脑妊娠周（GWS）12-27 的染色质可及性谱和基因表达的组合，以构建发育中人小脑的多组学细胞图谱 (Supplementary Data 1-3; Fig. 1a, b and Supplementary Figs. 1-2)。作者根据已知 marker 对 17 个主要细胞类群进行了分类: RL (rhombic lip), progenitors (MKI67 and ATOH1), VZ (ventricular zone) progenitors (PTF1A and MKI67), granule cells (MFAP4 and MGP), eCN (NEFM and NEUROD1), UBC (EOMES), Purkinje cells (PCP4 and RORA), GABAergic neurons (PAX2 and GAD1), Bergmann cells (GDF10 and PAX3), astrocytes (AQP4 and SOX9), OPCs (OLIG1 and PDGFRA), oligodendrocytes (MBP and APOD), and microglia (AIF1 and C1QB) (Fig. 1a, b, Supplementary Figs. 1c–e, 2c, d; Supplementary Data 4)。作者采用了 peak calling 方法，确定了总共 527,539 个开放染色质区域（OCRs），其中 31,347 个 peaks 与蛋白质编码基因启动子重叠。作者介绍了每个 cluster 的 ATAC-seq 信号的堆积，具有 top200 cluster-enriched peaks，以系统地确认使用 scATAC-seq 确定的细胞身份。经典的转录因子结合 motifs 在相应的细胞 clusters 中特异性检测到，基因功能（GO）分析表明，每个具有特异性峰的细胞类型都参与了相应的生物学过程（Supplementary Fig. 3a）。然后，作者分析了从 scATAC-seq 和 scRNA-seq 鉴定的细胞类型 cluster 之间的相关性，发现所有scATAC-seq clusters 均映射到 RNA-Seq clusters (Supplementary Fig. 3)。

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a-b. 使用 UMAP 在发育中的人类小脑中可视化 17 个主要类 RNA-seq 数据（a）和 13 类ATAC-seq 数据（b）。每个点代表一个细胞，并布置细胞以显示相似性。每种细胞颜色代表细胞类型（RL, rhombic lip; VZ, ventricular zone; eCN, excitatory cerebellar nuclei cell; UBC, unipolar brush cell; OPC, oligodendrocyte precursor cell）。\
c-d. 10x Genomics Visium 数据显示了 GW12（c）和 GW17（d）小脑中不同 cluster 的空间分布。在右侧使用相同布局显示已知 markers 的表达。\
e. DAPI 染色的图像显示了 GW19 小脑中 TF-SeqFish 的区域。TF-SeqFish 图显示了 GW19 小脑中不同细胞类型的空间分布。面板1、2、3分别显示 RL、VZ、小脑皮层。在右侧 TF-SeqFish 图显示了 GW19 小脑中使用相同的布局的小脑中的基因模式。比例尺，GW19，500μm。\
f. Sankey 图显示了 GW17 中 scRNA-seq，scATAC-seq，TF-seqFISH 和 10X Genomics Visium 数据之间的相关性。\
g. 热图显示了 GW12 小脑的空间特异性模块。\
h. 每个模块的基因模式与（c）中同一布局显示。\
i. 空间特异性模块的 GO 分析显示了 GW12 小脑中的 KEGG 通路或生物学过程。点显示了每个模块中的基因数，比例尺显示了 GO terms 的 -log(P-value)。超几何分布检验。
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2. 小脑发育中的空间转录组学定义的区域

为了表征区域基因表达谱，作者应用了两种空间转录组分析方法，一种 slide-based 的技术（10x Genomics Visium）（GW12, 17）和一种 multiplexed-FISH-based 的技术（TF-seqFISH）（GW12,19）(Fig. 1c-e and Supplementary Fig. 4)。作者根据人的小脑解剖结构定义了确切的区域信息，并验证了空间转录组结果中的 marker 基因表达。尽管 Visium 系统中的 spot 分辨率不在单细胞水平上，但它在 GW12 和 GW17 的每个 spot 分别具有 6007 和 3280 个中位数基因。在 TF-seqFish 中，作者使用了 1085 个转录因子（TFs）的探针来说明 TFs 在细胞命运确定中的作用。作者将这两个空间数据集与 scRNA-seq 数据集成在一起，以绘制单个细胞的空间分布和基因表达谱。作者确定了具有不同转录谱的 Visium spots clusters，这些 clusters 映射到不同的位置 (Fig. 1c, d, Supplementary Fig. 4d, e, i, j)。然后，使用 TF-seqFISH 数据集作为桥梁，作者研究了 Visium 中每个 spot 的单细胞组成，这也表明了从 scRNA-seq clusters 中所有细胞的空间定位（Fig. 1f, Supplementary Fig. 4f）。细胞类型定位和基因表达特征的表征很好。例如，progenitors 位于 GW12 的 VZ 和 RL 中；RORA+ Purkinje cells 早早出现为 GW12 的主要神经元，然后在 GW17 的小脑皮层的外边缘出现；AQP4+ astrocytes 仅在 GW17 中接近 VZ 的区域中检测到，这表明它们来自 VZ progenitors，比神经元晚（Fig. 1c-e, Supplementary Fig. 4）。

作者在 GW12 上组织了 21 个基因模块，发现这些模块与子区域高度相关（Fig. 1g, h, Supplementary Fig. 5 and Supplementary Data 5）。例如，来自 M19 的基因在 PCL 中的细胞中高度表达。对这些基因的 GO 分析还表明，它们在小脑浦肯野细胞层的发育和形成中起着作用（Fig. 1i）。一些模块与位于多个位置的细胞相关，例如 M10，其基因在 RL、EGL、EGL 迁移区域中高度表达，对于神经元分化和突触结构或活动的调节至关重要。此外，作者还发现，在某些情况下属于同一 GO term 的基因与不同的模块有关。例如，来自 M10、M16、M19 的基因在神经元迁移中均起着作用，并且与 RL、EGL、EGL migrating zones、VZ progenitor differentiating zone 的子区域高度相关，表明神经元迁移可以通过使用不同的基因来调节这些区域（Fig. 1g–i, Supplementary Fig. 5b）。

3. 祖细胞的分子特征

作者通过 RNA 速率来重建发育路径，不包含小胶质细胞，内皮细胞，T细胞，Schwann细胞，脑膜或其他从小脑外部衍生的神经元，以鉴定人类胎儿小脑的神经元和神经胶质分化的轨迹，并使用 RL 祖细胞和 VZ 祖细胞的两条路径作为起点（Fig. 2a, Supplementary Fig. 6a, b）。RL 祖细胞分化为小脑中的兴奋性神经元，包括颗粒细胞，UBCs 和 eCNs，而 VZ 祖细胞在神经发生中起着 GABA 能神经元和 Purkinje 细胞的神经发生作用，以及用于 astrocytes、OPCs，oligodendroctes、Bergmann glial 细胞的作用（Fig. 2a）。通过从 scRNA-seq 数据分析差异表达的基因（DEGs），作者确定了在这两种类型的祖细胞中表达的重要基因。发现 NRN1 和 IGFBP5 是 RL 祖细胞的替代标记基因，而 TTYH1 和 PTPRZ1 被认为是替代的 VZ 祖细胞标记基因（Fig. 2b; Supplementary Data 6）。通过分析空间转录组数据和免疫荧光染色来验证这些区域祖细胞标记（Fig. 2c and Supplementary Fig. 6c）。祖细胞通过 PCA 算法分为 8 组（Progenitor 1-Progenitor 8）（Fig. 2d, Supplementary Fig. 6d, e; Supplementary Data 7）。与轨迹分析相结合，作者发现祖细胞的 subclusters 显示出不同的细胞分化潜力（Fig. 2e and Supplementary Fig. 6f）。OTX2+ 和 EOMES+ 祖细胞位于 Clusters Progenitor 1 和 Progenitor 2 中，表明这些细胞是 UBC 生成的祖细胞。STMN2 和 MGP 分别高表达于 Clusters Progenitor 3 和 Progenitor 4 中，表明 eCN 和颗粒细胞的命运。Cluster Progenitor 7 包含高表达 LHX1 的祖细胞，表明这些细胞可能会分化为 GABA 能神经元或 Purkinje 细胞（Fig. 2e）。此外，与神经胶质分化有关的基因，例如 TTYH1，GFAP 和 FOXJ1，在 Progenitor 6 和 Progenitor 8 中分别高表达。谱系分析表明，Progenitor 6 可能是星形胶质细胞或 Bergmann 细胞的祖先，而 Progenitor 8 可能会分化为 OPC 和 oligodendrocytes（Fig. 2d, e, Supplementary Fig. 6f–h）。

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a. 人类小脑发育过程中 RL 谱系和 VZ 谱系的速率可视化。\
b. 所有基因与 RL 谱系（红色图）和 VZ 谱系（蓝色图）保守分化网络相关性的散点图。\
c. 10x Genomics Visium 数据显示 GW12 小脑中 RL 和 VZ 的空间分布。右侧使用相同布局展示区域标志物的表达。\
d. 热图展示 RL 祖细胞和 VZ 祖细胞中基因的表达水平和身份。热图右侧展示每种类型中特定基因的表达。\
e. 使用与 Fig. 2a 相同布局展示 UBC、eCN、颗粒细胞和 VZ 神经元谱系的速率可视化。其他谱系的细胞以灰色显示。\
f. 调控子-靶点模块展示小脑发育过程中从祖细胞到不同细胞类型的谱系轨迹。RL 谱系（上），VZ 谱系（下）。\
g. 顶部树状图展示小脑主要谱系中每个细胞类群的调控子（不包括小胶质细胞、脑膜、T 细胞、斯旺细胞、内皮细胞和其他神经元），展示小脑发育过程中的谱系轨迹。树状图每个分支处显示的转录因子（TFs）代表下方调控子组的典型代表。\
h. 使用与 Fig. 2a 相同布局在 UMAP 图中展示调控子 E2F2 的表达模式，黑色表示无表达，黄色表示相对表达。\
i. E2F2 在拟时序轴上 RNA（红色）和 ATAC（蓝色）的基因表达。阴影表示拟合曲线的 95% 置信区间。\
j-k. 10x Genomics Visium 数据展示 E2F2 基因在 GW12（j）和 GW17（k）小脑中的空间表达。\
l. 展示 E2F2 基因周围区域在不同细胞类型中的 Cicero 共可及性。\
m. 调控子-靶点模块展示 RL 谱系中小脑皮质和核团之间的分化点。\
n. RL 谱系中调控子 MEIS3、FOXN3、OLIG3 和 MSX1 的特征图。\
o. 皮质或核团模块靶点的 GO 术语。超几何检验。\
p. 调控子-靶点模块展示 VZ 谱系中神经元和胶质细胞之间的分化点。\
q. VZ 谱系中调控子 SOX4、TFAP2A、SOX2 和 HES5 的特征图。\
r. VZ 神经元或胶质细胞模块靶点的 GO 术语。超几何检验。
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4. 通过转录因子确定细胞命运

为了研究祖细胞中的基因表达如何协调并引导这些细胞分化为不同类型的神经元和胶质细胞，作者基于 scATAC-seq 和 scRNA-seq 数据进行了调控子（regulon）分析。具体而言，作者通过下游基因表达和 scATAC-seq 检测到的顺式调控元件（CREs）来识别活跃的转录因子（TF）调控子。作者首先将调控子组织成 20 个模块，并发现这些模块在特定细胞类型中高度富集（Supplementary Figs. 7a, b, and 8）。随后，作者描绘了这些调控子的网络和轨迹，并通过 RL 谱系和 VZ 谱系构建了调控层级的全景图（Fig. 2f, g）。在 RL 谱系中，作者观察到 RL 祖细胞高表达特定的转录因子，如 FOXM1 和 E2F2（Fig. 2f, g, Supplementary Fig. 7c, Point 1）。对 E2F2 下游基因的 GO 分析表明其在细胞周期调控中的作用（Supplementary Fig. 7d）。随着发育拟时序的推进，E2F2 的表达和启动子可及性逐渐降低（Fig. 2h–k）。接下来，作者使用 Cicero 进行了共可及性分析，发现 E2F2 的调控网络在不同细胞类型中存在差异（Fig. 2l）。E2F2 作为一种转录因子，在不同细胞类型中表现出不同的共可及性状态，表明 E2F2 在 RL 祖细胞中与附近的远端元件积极相互作用（Fig. 2l）。

在 RL 祖细胞分化途径中，RL 祖细胞在 KLF10 表达的驱动下分化为神经细胞（Fig. 2g, Point 1），KLF10 是一种与细胞周期抑制相关的调控因子。随后，空间受限的神经谱系被分离（Point 2），包括小脑皮质（OLIG3 和 MSX1）和小脑核团（FOXN3 和 MEIS3）（Fig. 2g, m, n, Supplementary Fig. 7e）。作者进一步鉴定了 Point 2 处转录因子的调控靶基因，发现小脑皮质和核团的发育可能分别受 WNT 信号和 BDNF 信号调控（Fig. 2o）。VZ 谱系中的调控网络更为复杂，因为神经元和胶质细胞起源于同一区域（Fig. 2 m, n）。

VZ 祖细胞分化为神经元（SOX4 和 TFAP2A）和胶质细胞（SOX2 和 HES5；Point 4）（Fig. 2g）。作者进一步研究了 Point 4 处关键转录因子的下游基因，发现了一些在 GABA 能突触和胶质细胞分化两个方向中参与细胞命运决定的关键基因（Fig. 2g, p–r and Supplementary Fig. 7f–h）。总的来说，作者基于 scRNA-seq 和 scATAC-seq 数据的综合分析构建的调控子图谱表明，转录因子以层级和组合的方式调控细胞命运，甚至单个转录因子的调控不仅依赖于其自身的 RNA 表达水平，还依赖于其调控能力，这些能力表现出细胞类型特异性和发育时序模式，以指导和微调人类小脑的发育。

5. 浦肯野细胞的分子和空间特征

浦肯野细胞（Purkinje cells）是一种 GABA 能神经元，负责将小脑皮质的主要输出传递至小脑核团（CN），从而控制运动和姿势功能。作者使用 Monocle3 对小脑发育过程中的 scATAC-seq 数据进行了轨迹分析，并构建了一条从 VZ 祖细胞到浦肯野细胞的路径，以研究调控浦肯野细胞发育的转录网络（Fig. 3a, Supplementary Fig. 9a, b）。在 VZ 祖细胞向浦肯野细胞分化的过程中，大量高表达基因的转录起始位点（TSSs）以伪时序依赖性的方式开放或关闭。例如，维持 VZ 祖细胞的关键转录因子 PTF1A 的 TSS 关闭，而浦肯野细胞的标志物如 PCP4、RORA 和 RORB 的 TSS 则随着伪时序的推进而开放（Fig. 3b, c, Supplementary Fig. 9c; Supplementary Data 8）。有趣的是，RORA 和 RORB 是 RAR 相关孤儿受体的两种形式，但它们在人类小脑发育过程中的表达模式不同。RORA 被认为是浦肯野细胞的经典标志物，而 RORB 则不是。表达这两种基因的细胞位置明显不同，RORB+ 细胞仅是 RORA+ 细胞的一个子集（Fig. 3c and Supplementary Fig. 9d）。通过搜索 TSS 中的 motif 结合位点，作者发现 VZ 祖细胞高表达的 PTF1A 可能结合到 RORA、RORB 和 CALB1 的启动子区域，表明 PTF1A 可能在调控这些下游基因的表达以引导浦肯野细胞分化中发挥作用（Fig. 3c and Supplementary Fig. 9e; Supplementary Data 9）。

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a. 在 ATAC-seq 中使用与 Fig. 1b（ATAC）相同的布局分析人类小脑发育过程中祖细胞和浦肯野细胞的细胞谱系关系。Monocle 恢复了一个从祖细胞开始到浦肯野细胞结束的分支单细胞轨迹。每个点代表一个单细胞；细胞颜色代表细胞类型（左）和伪时序（右）。其他谱系的细胞以灰色显示。\
b. 通过负二项回归生成并缩放的 VZ 祖细胞和浦肯野细胞的伪时序依赖性可及性平滑曲线，显示为每个位点最大可及性的百分比。展示了前 10000 个高表达的伪时序依赖性可及性位点。\
c. 使用与 Fig. 1b（RNA）相同的布局在 UMAP 图中展示调控子PTF1A、FOXP1、BCL11B、RORA、RORB 和 FOXP4 的表达模式，黑色表示无表达，黄色表示相对表达。左侧图表展示调控子的 motif 序列（左）；上述基因在伪时序轴上 ATAC（蓝色）的基因表达（中），阴影表示拟合曲线的 95% 置信区间；10x Genomics Visium 数据展示 GW12 小脑中基因的空间表达。\
d. 热图展示浦肯野细胞亚型中标志基因的表达水平和身份。\
e. GW12 空间数据中伪时序和亚型特异性基因模式。\
f. 使用 UMAP 和 FeuturePlots 展示人类小脑发育过程中九种浦肯野细胞亚型的轨迹分析，显示PCP4、RORA 和 RORB 的表达。每个点代表一个单细胞，细胞布局显示相似性。每种颜色代表细胞类型。\
g. GW16 小脑中 RORA 和 RORB 的 RNAscope 图像。比例尺：500 μm（上），100 μm（下）。实验独立重复三次，结果相似。\
h. 调控子 RORB 靶基因的 GO 分析，展示其在人类小脑发育过程中浦肯野细胞中靶基因的预测功能。
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为了进一步研究小脑浦肯野细胞的发育特征，作者使用 PCA 算法将浦肯野细胞分为 9 个亚群。不同亚型浦肯野细胞的成熟状态和差异表达基因（DEGs）也表现出不同的空间模式（Fig. 3d–f, and Supplementary Fig. 9f）。例如，C8 和 C9（SOX2 + NFIA/NFIB +）细胞是浦肯野细胞的前体细胞，位于 VZ 区域。与空间表达模式一致，RORB 仅在浦肯野细胞的三个亚群中表达（Fig. 3d, f）。RNAScope 显示的 RORA 和 RORB 表达也证实了 scRNA-seq 的结果，即在 GW16 小脑中，RORB+ 浦肯野细胞是 RORA+ 细胞的一个子集（Fig. 3g）。通过分析浦肯野细胞的 scATAC-seq 数据，作者检测到 RORB motifs 靠近多个浦肯野细胞经典标志基因的TSSs，包括 SCN2A、SLC12A5 和 DAB1（Supplementary Fig. 9g）。此外，对 RORB 靶基因的 GO 分析表明，RORB 可能在小脑发育过程中浦肯野细胞层的形成、轴突发生和突触信号传递中发挥重要作用（Fig. 3h）。小脑皮质的分区条纹结构是小脑皮质的一个重要标志。根据空间转录组图谱，两个亚群（sp-P1 和 sp-P2）表现出明显的条纹状分区特征。对这两个浦肯野细胞亚群中 DEGs 的分析揭示了不同的分子特征（Supplementary Fig. 9h–k），表明浦肯野细胞条纹在发育过程中的空间基因表达模式。

6. 颗粒细胞的发育和空间差异

颗粒细胞（Granule cells）是小脑中最丰富的兴奋性神经元。为了研究颗粒细胞的发育特征，作者首先检测了从 RL 到颗粒细胞祖细胞的基因表达和染色质开放状态，发现 HEY1 是决定颗粒细胞命运的关键转录因子（Figs. 2g and 4a–c; Supplementary Data 10）。此外，对 HEY1 下游基因的 GO 分析表明，HEY1 在调控颗粒细胞前体增殖、神经元迁移和神经元投射导向中发挥重要作用（Fig. 4d）。

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a. 散点图展示颗粒细胞中通过映射到 hg19 人类基因组注释的高表达 peaks。\
b. HEY1 在伪时序轴上 RNA（绿色）和 ATAC（黑色）的基因表达，阴影表示拟合曲线的 95% 置信区间。\
c. 使用与 Fig. 1b（RNA）相同布局在 UMAP 图中展示调控子 HEY1 的表达模式，黑色表示无表达，黄色表示相对表达。\
d. 调控子 HEY1 靶基因的 GO terms。超几何检验。\
e. 热图展示颗粒细胞发育阶段的差异。右侧 GO 分析展示颗粒细胞不同阶段的生物学功能。超几何检验。\
f-g. 散点图（f）和 GO（g）分析展示早期（红色图）和晚期（蓝色图）增殖颗粒细胞之间的差异表达基因。超几何检验。\
h. GW16、GW21和 GW27 中 CALB1 和 PAX6 的免疫荧光图像。比例尺：GW16，500 μm（左），200 μm（右上），100 μm（右下）；GW21，1000 μm（上），300 μm（左下），100 μm（右下）；GW27，1000 μm（上），300 μm（左下），100 μm（右下）。实验独立重复三次，结果相似。\
i-k. 空间特异性基因模块展示从 RL 到 EGL 分化过程中的基因模式（i, j）。模块 2 和 6 分别与 RL 和 EGL 区域相关。GO 术语展示该过程中的 KEGG 通路（k）。超几何检验。\
l-n. 空间特异性基因模块展示从 EGL 到 IGL 分化过程中的基因模式（l, m）。模块 13 和 14 分别与 EGL 和 IGL 区域相关。GO 术语展示该过程中的 KEGG 通路（n）。超几何检验。\
o. 10x Genomics Visium 数据展示 GW17 小脑中颗粒细胞四个亚群的空间分布及不同标志物的表达。
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为了揭示颗粒细胞的分子特征，作者根据其发育阶段将其分为三组。不同阶段富集的差异表达基因（DEGs）的 GO 术语表明，细胞分裂是 GW12-14 期间发生的主要事件，随后是神经元迁移（GW16-21）和轴突发生（GW24-27；Fig. 4e）。有趣的是，神经元的分裂和迁移从 GW12 持续到 GW27，表明颗粒细胞在很长一段时间内持续增殖。接下来，作者研究了颗粒细胞增殖早期和晚期阶段的差异。作者对所有颗粒细胞进行了亚群分组，然后分析了细胞周期和轨迹（Supplementary Fig. 10a–d）。作者发现亚群 2 和 5 是处于 S 期和 G2/M 期的细胞，并位于轨迹图的起点。作者将这些颗粒细胞分类为早期和晚期增殖细胞，DEGs 表明 NOTCH 信号和 WNT 信号分别参与了早期和晚期阶段（Fig. 4f, g; Supplementary Data 11）。

接下来，作者使用免疫染色技术检测了 GW16、21 和 27 时期颗粒细胞的迁移情况。在 GW16 时，只有少数位于 EGL 的颗粒细胞开始向内迁移，而在 GW27 时，人类小脑中观察到了 IGL 的形成（Fig. 4h）。由于颗粒细胞在迁移过程中会经过位于 EGL 和 IGL 之间的浦肯野细胞和 Bergmann 细胞，作者通过 iTALK 分析研究了这些细胞之间的相互作用。作者发现浦肯野细胞和 Bergmann 细胞均通过生长因子 PTN 信号促进颗粒细胞的迁移（Supplementary Fig. 10e–h）。这些观察表明，颗粒细胞在发育过程中的位置对其生物学过程非常重要。在颗粒细胞生成过程中，颗粒祖细胞首先从 RL 分化并迁移到 EGL，然后从 EGL 迁移到 IGL。为了了解整个过程的分子特征和调控信号，作者分析了 GW12 和 GW17 的空间转录组数据。作者分析了 20 个基因模块，其中模块 2 的基因在 RL 中富集，主要参与细胞周期的调控（Fig. 4i）。模块 6 的基因在 GW12 的 EGL 中富集，表明这些细胞受 NOTCH 信号调控（Fig. 4i–k, Supplementary Fig. 10i），这与早期增殖颗粒细胞的观察结果一致（Fig. 4g）。GW17 的 EGL 表达的基因（模块13）与 GW12 的 EGL 不同，这些基因涉及 Hippo、MAPK、TGF-β 和 BDNF 信号通路（Fig. 4l–n, Supplementary Fig.10j）。IGL 在 GW17 形成，其表达的基因参与细胞迁移的调控以及 WNT 和 BMP 信号通路（Fig. 4n）。此外，作者分析了空间转录组数据并将其分为 4 个亚群（G1-G4），这些亚群在 GW17 组织中表现出明显的区域化特征。G1 细胞被认为是 EGL，而 G2-G4 代表不同小叶中的 IGL，具有独特的基因表达特征（Fig. 4o）。总体而言，作者发现浦肯野细胞和颗粒细胞在时空转录上存在差异，并可能以协调的方式相互作用和发育。

7. 哺乳动物小脑发育的物种差异

与人类小脑在产前发育过程中形成 IGL 不同，小鼠的 IGL 形成发生在出生后，这表明小脑的发育可能在啮齿类动物和人类之间存在进化差异。因此，作者使用 Glmnet 算法基于单细胞转录组数据对小鼠和人类小脑的发育阶段进行了年龄匹配。作者发现，人类 GW12-GW27 时期的小脑与小鼠从胚胎第 15 天（E15）到出生后第 2 天（P2）的小脑具有可比性（Fig. 5a and Supplementary Fig. 11a–c），这表明人类小脑的发育启动得更早。接下来，作者比较了人类（GW12-27）和小鼠（E15-P2）小脑的 scRNA-seq 数据，并使用 CCA 算法分析了两个物种之间细胞类型和基因表达谱的差异（Fig. 5b, c; Supplementary Data 12, 13）。大多数细胞类型在物种间是相似的，但仍显示出不同的基因表达谱（Fig. 5c）。有趣的是，作者还发现了几种神经元亚型具有人类特异性，包括 eCN（Cluster 49）、颗粒细胞（Cluster 50）、浦肯野细胞（Cluster 51）和 RL 祖细胞（Cluster 45；Fig. 5b）。

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a. 图表展示了人类小脑发育阶段对应的小鼠年龄预测。蓝色三角形表示小鼠小脑发育的真实年龄和预测年龄，红点表示人类数据对应的小鼠预测年龄（GW12: E15，GW14: E16，GW16-20: E18，GW24: P0，GW27: P2）。\
b. 使用 CCA 分析并基于 CCA 联合 clusters（上中）和细胞类型进行颜色编码的人类（GW12-27）和小鼠（E15-P4）神经谱系细胞类型的 tSNE 可视化。左上图显示人类细胞类型，右上图显示小鼠细胞类型，每个点代表一个单细胞。河流图比较了人类和小鼠细胞类型与 CCA 联合 clusters 的分配。\
c. 热图展示人类（GW12-27）和小鼠（E15-P4）小脑之间的保守基因、小鼠特异性基因和人类特异性基因。\
d. 人类和小鼠浦肯野细胞之间基因表达的成对比较。红点（人类）和蓝点（小鼠）表示跨物种的差异表达基因。\
e. 人类和小鼠浦肯野细胞中 RORB、CA8、FOXP1 和 CNTNAP2 表达的小提琴图。\
f. 10x Genomics Visium 数据展示 GW17 小脑中 RORB、CA8、FOXP1 和 CNTNAP2 的表达。\
g. 人类 GW16 和小鼠 P0 中 RORB 和 CALB1 的免疫荧光图像。比例尺：人类 GW16 为 300 μm（左）和 100 μm（右）；小鼠 P2 为 300 μm（左）和 100 μm（右）。实验独立重复三次，结果相似。\
h. 人类小脑祖细胞中 ARHGAP11B、ASPM、SGOL2、NMU 和 MXD3 表达的小提琴图。\
i. 10x Genomics Visium 数据展示 GW12 小脑中 ARHGAP11B、ASPM、SGOL2、NMU 和MXD3 的表达。\
j. 在 E11.5 过表达 ARHGAP11B 促进小鼠 P2 时小脑皮质的折叠。比例尺：500 μm。\
k. P12 时小鼠小脑皮质面积和周长的量化。**P < 0.01，P值（面积）=0.0024，P值（周长）=0.0015，双侧 t 检验，n = 3个生物学独立动物。平均值±标准误差。
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值得注意的是，通过比较人类和小鼠的浦肯野细胞，作者发现了 246 个在人类中选择性表达的基因（Fig. 5d）。对这些基因空间信息的分析也表明这些基因的区域性表达，例如 RORB、CA8、FOXP1 和 CNTNAP2，它们在人类浦肯野细胞中特异性高表达（Fig. 5d–f）。如前所述，RORB 是作者观察到的人类浦肯野细胞亚群的标志基因（Figs. 3d–g, 5e, f），可能在调控浦肯野细胞分化和成熟中发挥重要作用。免疫染色进一步验证了 RORB 在人类 GW16 和 GW27 的浦肯野细胞（CALB1+细胞）中可检测到，但在小鼠 P2 的浦肯野细胞层中未检测到（Fig. 5g）；这并不是由于抗体的物种特异性，因为作者在同一样本的小鼠大脑皮层中观察到了 Rorb+ 细胞（Supplementary Fig. 11d）。有趣的是，基于发育中和成年小鼠大脑的原位结果（www.brain-map.org），作者发现 Rorb+ 细胞存在于小鼠 E13.5 和 E15.5 的 VZ 祖细胞中，但不存在于分化的浦肯野细胞中（Supplementary Fig. 11e–k），这表明 Rorb 可能仅在小鼠浦肯野细胞发育的早期阶段发挥作用。

与其他祖细胞相比，人类特异性 RL 祖细胞（Cluster 45）的差异表达基因定位于 RL 和 EGL，表明其细胞命运向颗粒细胞分化（Fig.5h,i）。这些 RL 祖细胞高表达 ARHGAP11B，这是一个人类特异性基因，被认为与哺乳动物大脑皮层的扩张和折叠有关（Fig.5h,i）。为了进一步研究 ARHGAP11B 在小脑发育中的作用，作者在 E11.5 时短暂表达了 ARHGAP11B 于小鼠小脑祖细胞中，并在 P12 时观察到小脑皮层的扩张和额外的折叠结构，这可能是由于颗粒细胞数量的增加所致（Fig. 5j, k, Supplementary Fig. 11l–n），这一过程可能通过基于线粒体的祖细胞代谢调控实现。总体而言，作者发现尽管小脑被认为是大脑中进化上保守的区域，但人类小脑在发育过程中仍表现出与小鼠在细胞类型和基因表达谱上的差异。

8. 不同细胞类型中的疾病相关基因和 SNPs

编码区和非编码区的突变与导致小脑功能障碍的疾病和病症相关。接下来，作者析了疾病相关基因以及单核苷酸多态性（SNPs）在不同细胞类型中的表达和染色质可及性模式，这些疾病包括脊髓小脑共济失调、先天性小脑发育不全、桥小脑发育不全、智力障碍、Joubert 综合征、自闭症谱系障碍（ASD）、髓母细胞瘤和双相情感障碍（Fig. 6a, b, Supplementary Fig. 12; Supplementary Data 14）。总体而言，97.5% 的双相情感障碍相关 SNPs 和 49.5% 的 ASD 相关 SNPs 位于非编码区，而在其他疾病中，大多数 SNPs 位于编码区（Fig. 6a）。作者发现，与桥小脑发育不全和 Joubert 综合征这两种发育性疾病相关的编码基因在 RL 和 VZ 祖细胞中富集。涉及 ASD 的编码区和非编码区 SNPs 均在浦肯野细胞中富集。作者进一步使用 scRNA-seq 数据分析了编码区 SNPs 的细胞类型特异性（Supplementary Fig. 12a），并使用 scATAC-seq 数据分析了非编码区 SNPs 的细胞类型特异性（Fig. 6b）。在这 1,619 个含有 SNPs 的基因中，作者发现 1,355 个基因的 SNPs 位于编码区或非编码区，而 264 个基因的 SNPs 同时位于编码区和非编码区。在这 264 个基因中，46.59% 的基因含有与不同疾病表型相关的 SNPs（Supplementary Data 15）。例如，CNTNAP2 基因被确定为与 ASD 患者语言发育迟缓相关的基因，其在浦肯野细胞中高表达。接下来，作者分析了疾病相关 DNA 突变所在非编码区的染色质开放状态及其细胞类型特异性（Fig. 6b, c, Supplementary Fig.12b）。FOXP1 基因的染色质开放状态在浦肯野细胞中富集，该基因的功能障碍已被报道与智力障碍和语言缺陷相关。值得注意的是，CNTNAP2 和 FOXP1 在人类发育中的浦肯野细胞中表现出物种特异性（Fig. 5e, f）。此外，SPTBN2 和 PLEKHG4（puratrophin-1）基因中的 C-to-T 替换已知与脊髓小脑共济失调相关。作者发现，在人类发育中的小脑中，SPTBN2 突变位点的染色质在 RL 祖细胞、颗粒细胞和 GABA 能细胞中开放，而 PLEKHG4 突变位点的染色质仅在小胶质细胞中开放，这表明小脑疾病不仅可能与细胞类型特异性基因表达谱相关，还可能与其染色质可及性状态相关（Fig. 6b, c）。

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![Fig. 6: 人小脑疾病
](https://files.mdnice.com/user/46361/12fed1b8-e520-47c9-9b5d-5...)

a. 每种细胞类型中疾病相关基因的聚合表达（编码区，左；非编码区，右）。\
b. ATAC 数据集中每种细胞类型中选定疾病相关基因的表达模式。\
c. 小脑中 SPTBN2 和 PLEKHG4 的标准化 ATAC-seq 图谱，所有细胞类型均显示 SPTBN2 和 PLEKHG4 的激活。
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讨论

通过高通量并行单细胞染色质状态和基因表达分析，作者构建了早期和中期妊娠人类小脑的综合空间基因表达和调控图谱，揭示了这一发育过程中多种细胞类型的分子特征和基因表达动态。值得注意的是，这些多组学数据还阐明了神经发生和胶质发生过程中祖细胞分化和细胞命运决定的分子调控机制。作者的网络表明，细胞命运决定以层级方式发生，并且多个转录因子（TFs）的组合在细胞命运分叉的每个节点中至关重要。有趣的是，TF 基因在不同细胞类型和不同发育时期的动态表达以及 TF 的共可及性均表现出细胞类型和时间差异，这与人类皮质发育相似，表明人类小脑发育过程中由 TFs 调控的复杂基因表达与染色质结构状态密切相关。

作者将单细胞转录组数据与空间信息相结合，为小脑发育程序提供了宝贵的信息。先前的研究描述了 RL 和 VZ 祖细胞的空间转录组信息，但未在单细胞分辨率下分析分化细胞。已知浦肯野细胞和颗粒细胞表现出具有独特分子特征的空间模式，但这些研究通常基于 10x Genomics Visium 数据和组织免疫染色。因此，作者整合的空间多组学图谱帮助我们将基因编码的细胞类型和结构发育与人类小脑皮质不同区域的回路形成和功能多样化联系起来。在早期发育的小脑（GW12）中，FOXP1+ 和 RORB+ 细胞可以被视为位于不同区域的两个浦肯野细胞亚群。作者还发现了早期发育阶段不同亚位置浦肯野细胞的特定基因表达模式。位于不同条纹中的浦肯野细胞具有不同的神经投射和连接性，这些差异可能在早期发育的浦肯野细胞中就已经开始形成。

人类小脑的发育时间较长，从受孕后 30 天持续到出生后 2 年。基于单细胞转录组相似性，作者的分析表明，E15.5 至 P2 小鼠的发育阶段与人类 GW12-27 的发育阶段相似，表明人类小脑的发育比小鼠小脑早得多；然而，整体细胞类型的出现顺序是保守的。除了在运动控制中的重要作用外，人类小脑还参与多种认知功能。单细胞转录组水平的跨物种比较表明，某些细胞亚型仅存在于人类中。由于作者分析的是发育数据集，细胞亚型可能仅反映细胞在发育过程中的短暂状态。然而，作者仍然认为这些结果中的一部分可能为了解人类小脑的进化和功能提供了机会。首先，作者确定 RORB 为发育中浦肯野细胞某些亚群的标志基因，可能在调控浦肯野细胞分化和成熟中发挥作用。RORA 和 RORB 都是视黄酸相关孤儿受体，具有较高的序列同源性和保守结构域。RORA 是浦肯野细胞的经典标志物，而 RORB+ 浦肯野细胞仅是 RORA+ 细胞的一个子集，在早期发育中表现出明显的区域化分布，但在后期分布相对重叠。值得注意的是，与 RORA 不同，RORB 在进化上并不保守，其在小鼠浦肯野细胞中不表达，仅在小鼠 VZ 祖细胞中表达。RORB 在大脑和视网膜中高表达，作为保守的皮质第四层神经元标志物，并在视网膜神经发生中起关键作用。根据最近的一项研究，RORB 的功能缺失突变会破坏兔子的跳跃运动，这是由于脊髓中间神经元群体分化缺陷所致。然而，RORB 在人类浦肯野细胞中的功能仍需进一步研究。

颗粒细胞是成年人类大脑中最丰富的神经元类型。人类小脑皮质的进化不仅体现在表面积显著扩展和更复杂的折叠结构上，还体现在颗粒细胞总数的增加上。小脑颗粒细胞前体由 RL 祖细胞生成并迁移形成 EGL，随后产生颗粒细胞并迁移至 IGL。发育数据非常重要，因为它们描述了祖细胞的分子特征，这可能为小脑皮质扩展的机制提供一些线索。所有发育阶段（GW12-27）的颗粒细胞均匀分布在亚群中，表明颗粒细胞经历了长时间的增殖和分化，这可能是最终形成庞大细胞群的原因。有趣的是，作者发现人类特异性基因 ARHGAP11B 在 RL 祖细胞中高表达，该基因在人类皮质基底祖细胞中表达并促进人类大脑皮质在进化过程中的扩展和折叠，从而将这些细胞与小鼠 RL 祖细胞区分开来。在小鼠小脑祖细胞中表达 ARHGAP11B 会导致小鼠小脑皮质扩展，形成更多的颗粒细胞和更复杂的折叠结构。在人类皮质发育过程中，ARHGAP11B 通过抑制线粒体通透性转换和诱导谷氨酰胺分解促进基底祖细胞的增殖。作者的观察表明，人类小脑皮质的扩展和折叠与人类新皮质的扩展和折叠同步发生，并可能共享相似的分子机制和基因进化。此外，作者观察到从妊娠早期到中期颗粒细胞持续生成，并发现了一组在人类中占主导地位的颗粒细胞，其特征是表达成熟神经元的典型基因，这表明在胎儿小脑发育过程中，人类颗粒细胞的生成和成熟比小鼠更早。这种早期启动和长期生成的特征可能是颗粒细胞成为大脑中最丰富神经元类型的原因。

尽管作者的空间多组学数据集仅涵盖了人类胎儿小脑的早期到中期发育，但这一时期是神经发生和胶质发生的关键窗口，这些过程对成人小脑的结构和功能至关重要。除了描绘人类小脑发育的全景图外，作者的研究还提供了一个综合数据集，将有助于进一步研究与小脑相关的疾病，包括神经发育障碍和成人发病的疾病。先前的研究表明，位于脑室下区的 RL 祖细胞是第 3 组和第 4 组髓母细胞瘤的来源。有趣的是，作者发现 FOXP1 和 CNTNAP2 这两个与疾病相关的基因不仅在发育过程中在浦肯野细胞中高表达，而且在人类中特异性高表达，而在小鼠中不表达，这表明这些疾病可能是由发育异常引起的，尤其是人类浦肯野细胞的功能障碍。GWAS 数据与作者的单细胞多组学数据的交叉分析不仅有助于研究疾病起源的细胞类型，还能提供编码区或瞬时可及位点的基因组突变图谱，并结合细胞类型和发育时间信息，这将为研究神经精神疾病的发病机制提供非常有力的工具。

总之，作者结合单细胞染色质可及性状态、空间转录组和单细胞转录组，系统地描绘了 GW12-27 期间人类小脑发育的分子特征和细胞组成的综合空间图谱。作者揭示了细胞命运决定以层级方式进行，并且多个转录因子（TFs）的组合在细胞命运分叉的每个节点中至关重要，为细胞命运决定提供了丰富的信息化 TF 图谱及其可及性状态。通过空间转录组分析，作者发现不仅不同位置的祖细胞（如 RL 和 VZ）表现出差异化的基因表达谱，发育中的神经元（如浦肯野细胞和颗粒细胞）也显示出时空特异的分子特征，这可能与其功能相关。人类和小鼠的跨物种比较表明，某些细胞亚型和基因仅存在于人类中。首先，作者发现 RORB 作为发育中浦肯野细胞某些亚群的标志基因，在调控浦肯野细胞分化和成熟中发挥作用。值得注意的是，RORB 在小鼠浦肯野细胞中不表达，仅在小鼠 VZ 祖细胞中表达。其次，作者还发现人类特异性基因 ARHGAP11B 在 RL 祖细胞中高表达，该基因在进化过程中促进人类大脑皮质的扩展和折叠。有趣的是，在小鼠小脑祖细胞中表达 ARHGAP11B 会导致颗粒细胞数量增加和小脑皮质扩展，以及更复杂的折叠结构，这表明人类小脑皮质的扩展和折叠与人类新皮质的扩展和折叠同步发生，并可能共享相似的分子机制和基因进化。最后，作者还揭示了与小脑发育障碍相关的 SNPs 可以映射到特定细胞类型的编码区和非编码区。作者发现一些与疾病相关的基因仅在人类中表现出时空和细胞类型特异性的表达模式，这为人类神经精神疾病的发病机制提供了可能的解释。

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