文献阅读 | Nature | 新皮质投射神经元规范，发育和多样性的分子逻辑

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文献介绍

文献题目： 新皮质投射神经元规范，发育和多样性的分子逻辑 \
研究团队： Jeffrey D. Macklis（美国哈佛大学）\
发表时间： 2013-10-09 \
发表期刊： Nature reviews neuroscience \
影响因子： 28.7\
DOI： 10.1038/nrn3586
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摘要

新皮层的精密神经环路由发育过程中在精确分子调控下产生的多种神经元亚型组装而成。近年来，研究人员已鉴定出调控新皮层投射神经元特化与分化的若干关键因子。本研究深入揭示了皮层发育的"分子逻辑"，并进一步支持以下模型：个体祖细胞阶段和有丝分裂后调控因子被嵌入高度互联的网络中，共同调控连续的发育决策。本文系统整合了指导新皮层投射神经元亚型与区域身份渐进式发育和分界的分子调控机制。

研究结果

哺乳动物新皮层负责处理多种感觉信息、控制运动输出并介导高级认知功能。其仅由六个组织学分层构成的架构，掩盖了作为强大神经计算回路基础的神经元亚型的惊人多样性。近年来，在理解这些新皮层神经元多样化发育的分子机制方面已取得重大进展。

新皮层主要包含中间神经元（interneurons）和投射神经元（projection neurons）两大类神经元。中间神经元在新皮层内建立局部连接，主要起抑制作用，由端脑腹侧增殖区（皮层下）祖细胞产生后迁移至新皮层。而投射神经元则向远端脑区发送轴突，具有兴奋性，源自端脑背侧增殖区（皮层）祖细胞。关于中间神经元多样性及发育的综述见其他文献，本文聚焦于投射神经元。

既往研究通过树突形态、电生理特性或投射模式等表型特征对投射神经元进行分类。虽然这些分类体系促进了投射神经元发育与功能研究，但要更全面理解神经元多样性，需将这些表型特征与转录组和表观组数据，甚至单神经元水平进行整合。本文主要依据轴突靶向区域对神经元进行分类（Box 1），既因神经连接学与功能密切相关，又因正确投射模式的建立需要逐步执行复杂的发育程序。

投射神经元通过三个发育轴逐步获得亚型与区域身份：时序轴（time）、亚型分化轴（subtype differentiation）、区域分化轴（area differentiation）。现有研究多单独探讨各轴线，描述祖细胞或有丝分裂后神经元中特定分子的调控作用。但越来越清楚的是，亚型与区域身份的特化及其时序调控既相互关联又彼此依赖。本综述探讨小鼠投射神经元亚型与区域身份特化的转录调控机制：首先解析祖细胞中决定谱系限制性和位置信息的分子程序，继而分析有丝分裂后神经元中指导轴突靶向投射及优化基因表达与连接模式的机制。在每个阶段，本文将探讨遗传程序如何在多维"身份空间"中建立不同投射神经元亚型及皮层区域间的边界。

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投射神经元根据轴突延伸范围可分为三大类：在同一半球内投射的联合投射神经元（associative projection neurons）、跨中线投射至对侧半球的连合投射神经元（commissural projection neurons），以及向皮层外结构投射的皮质传出神经元（corticofugal projection neurons）。值得注意的是，相同亚型神经元在不同皮层功能区（运动区、体感区、视觉区和听觉区）会投射至解剖和功能不同的靶区。

大多数连合投射神经元（commissural projection neurons）通过胼胝体（corpus callosum, CC）跨中线投射，称为胼胝体投射神经元（callosal projection neurons, CPN），少数通过前连合投射（Box 1a）。CPN 主要分布于 layer II/III，少量位于 layer V/VI，其轴突投射至对侧半球相同功能区的镜像位置，实现信息的双侧整合。

联合投射神经元（associative projection neurons）存在于所有皮层，包括：短程半球内投射神经元（轴突限于单个或邻近皮层柱内，如 layer IV 颗粒神经元）和长程半球内投射神经元（轴突投射至相邻或远端皮层区，如前向与后向投射神经元）（Box 1b）。

皮质传出神经元（corticofugal projection neurons）包含：位于 layer VI 的皮质丘脑投射神经元（corticothalamic projection neurons, CThPN）和位于 layer V 的皮质下投射神经元（subcerebral projection neurons, SCPN）（Box 1c）。CThPN 靶向特定丘脑核团：运动皮层（M1）CThPN 投射至腹外侧核（VL）与腹前核，体感皮层（S1）CThPN 投射至腹后核（VP），视觉皮层（V1）CThPN 投射至外侧膝状体（LGN）。SCPN 则投射至脑干和脊髓（SC）的不同初级靶区：M1 SCPN 投射至 SC（皮质脊髓运动神经元）和脑干运动核（皮质-脑干运动神经元）；S1 SCPN 投射至三叉神经感觉主核和延髓薄束核（皮质延髓投射神经元）；V1 SCPN 投射至视顶盖（OT）（皮质顶盖投射神经元）。

部分多靶投射神经元可归入多个类别（Box 1d），例如：具有额叶投射的 CPN（轴突同时投射至对侧半球和同侧额叶皮层）；具有后向投射的 SCPN（轴突同时投射至皮质下靶区和同侧尾侧皮层）；以及端脑内皮质纹状体投射神经元（轴突同时投射至对侧半球和同侧纹状体（Str））。而其他多靶点投射神经元（如锥体皮质纹状体投射神经元）则仅能归入单一类别。

A1, primary auditory cortex; Crb, cerebellum; OB, olfactory bulb; Th, thalamus.
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1. 祖细胞特化

1.1 祖细胞多样性与皮层发生

发育早期，端脑壁由未分化的神经上皮细胞构成（Fig. 1a）。随着这些祖细胞增殖扩增，部分细胞开始分化为放射状胶质细胞（radial glia, RG），形成脑室区（ventricular zone, VZ）。放射状胶质细胞进一步产生其他祖细胞类型，包括外层放射状胶质细胞（outer radial glia, oRG）和中间祖细胞（intermediate progenitors, IP），共同构成脑室下区（subventricular zone, SVZ）。

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该示意图展示了小鼠胚胎发育过程中新皮层投射神经元亚型的时序性产生及其向特定皮层层的迁移过程。\
a. 脑室区（VZ）的放射状胶质细胞（RG）约在胚胎第 11.5 天（E11.5）开始产生投射神经元。同期，RG 还生成中间祖细胞（IPs）和外层 RG（oRG），这些细胞共同形成脑室下区（SVZ）并通过"迁移-扩增"机制增加神经元产量。神经发生完成后，神经祖细胞转为胶质生成模式，产生星形胶质细胞和少突胶质细胞（未展示）。Cajal-Retzius（CR）细胞主要从非皮层区域迁移至新皮层 layer I，而其他投射神经元则起源于新皮层 VZ 和/或 SVZ，并沿放射状胶质纤维迁移至目标皮层。\
b. 不同投射神经元亚型在神经发生过程中呈波浪式依次产生。底板神经元（subplate neurons，SPN）生成高峰约在 E11.5，皮质丘脑投射神经元（corticothalamic projection neurons，CThPN）和皮质下投射神经元（subcerebral projection neurons，SCPN）的生成高峰分别位于 E12.5 和 E13.5，Layer IV 颗粒神经元（granular neurons，GN）约在 E14.5 产生。部分胼胝体投射神经元（callosal projection neurons，CPN）从 E12.5 开始生成，与 CThPN/SCPN 同期生成的 CPN 也迁移至深层。多数 CPN 在 E14.5-E16.5 产生并迁移至浅层。峰值大小反映各亚型神经元每日生成量的相对比例。NE：神经上皮细胞。
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这些祖细胞群体各具独特的形态特征和分裂模式。放射状胶质细胞（radial glia）贯穿整个皮层厚度，其顶端突起连接脑室表面，基底突起延伸至软脑膜表面，为新生神经元迁移提供支架。它们主要通过不对称分裂实现自我更新，同时产生外层放射状胶质细胞（outer radial glia）、中间祖细胞（intermediate progenitors）、神经元（neurons）。外层放射状胶质细胞（outer radial glia）同样呈单极形态，但因缺乏顶端突起而可被区分。这类细胞最初在人类发育皮层的外脑室下区（outer SVZ）中被鉴定，曾被认为仅存在于有沟回哺乳动物，但近期研究证实啮齿类动物 SVZ 中也存在少量此类细胞，通过不对称分裂实现自我更新和神经发生。中间祖细胞（intermediate progenitors）具有多极形态，与放射状胶质细胞不同，其不与皮层顶底表面锚定，主要作为过渡放大细胞（transit-amplifying cells）进行有限增殖分裂，通常通过对称分裂直接产生两个神经元。第四类祖细胞——短神经前体细胞（short neural precursors）位于 VZ 区，其基底突起不达软脑膜，其他特征与中间祖细胞相似，可能是向中间祖细胞转化的放射状胶质细胞。

小鼠新皮层祖细胞（Neocortical progenitors）约在胚胎 10.5 天（E10.5）开始产生兴奋性投射神经元。最早出生的神经元通过迁移脱离脑室区，形成前板（preplate）；后期产生的神经元迁入前板后将其分割为边缘带（marginal zone）和底板（subplate），并在两者间形成皮层板（cortical plate）。在后续皮层发生过程中，新生神经元以"由内向外"（inside-out）模式迁入皮层板（Fig. 1b）——早期产生的神经元定位于深层（先是 layer VI 后是 layer V），而晚期神经元则穿过深层定位于更浅层（layer IV，然后是 layer II/III）。

1.2 祖细胞谱系定向

新皮层祖细胞总体上通过连续波次产生不同投射神经元亚型，但从祖细胞到特定神经元亚型的谱系关系，以及决定神经元亚型产生顺序的分子机制仍不清楚。

一个被广泛接受的祖细胞谱系定向模型认为，单一祖细胞谱系产生所有投射神经元亚型，祖细胞生成特定亚型的能力随发育逐渐受限。支持该模型的证据包括：将早期祖细胞移植至晚期皮层仍能产生所有亚型，而晚期祖细胞移植至早期皮层仅能生成浅层亚型。此外，逆转录病毒谱系追踪显示，皮层发生早期标记的单个祖细胞能产生全层神经元，而晚期标记的祖细胞主要产生浅层神经元。原代皮层祖细胞和胚胎干细胞来源祖细胞的体外研究也表明，它们能自主重现体内皮层发生的神经元亚型时序性产生特征。虽然这些方法证明祖细胞群体整体能力随时间变窄，但并未证实每个祖细胞最初都具有产生所有亚型命运的能力。这些发现也可能反映不同谱系定向祖细胞群体相对丰度的时序变化。

另一个祖细胞多样化模型提出，独立的命运限制性祖细胞谱系产生特定神经元亚型。早期证据来自观察到多个亚型特异性转录因子在发育早期的祖细胞中表达，提示不同祖细胞亚群可能定向产生特定投射神经元。例如 fez 家族锌指蛋白 2（Fezf2；原称 Fezl）主要在深层神经发生期稀疏表达于增殖区，其有丝分裂后表达特异性存在于皮质传出投射神经元（CFuPN）。相反，Cux1 和 Cux2 主要在浅层神经发生期表达于 VZ 和 SVZ，其有丝分裂后表达特异性存在于胼胝体投射神经元（CPN）和其他浅层神经元。新皮层存在部分谱系定向祖细胞的直接证据来自近期利用内源性 Cux2 启动子控制他莫昔芬诱导型 Cre 重组酶小鼠进行的遗传命运图谱实验。该研究证明，从皮层发生最早阶段就存在的一个祖细胞亚群专门产生 CPN 和其他浅层神经元亚型（Fig. 2a）。在深层神经元产生期间，Cux2 阳性祖细胞主要进行增殖性分裂，在仅产生少量神经元的同时扩增群体；后期则转为神经发生性分裂模式产生浅层神经元。尽管作者认为 Cux2 谱系衍生的早生神经元成为深层 CPN，但深层中大量 Cux2 命运图谱细胞是中间神经元，这使单标记表达分析的解读复杂化。使用更多独立遗传谱系追踪方法的进一步研究可能会揭示皮层祖细胞谱系关系的额外复杂性。

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a. 命运图谱实验证实，多数浅层（commissural and associative）投射神经元源自 Cux2+ 祖细胞，而深层（corticofugal）神经元源自 Cux2- 祖细胞。现有多个模型阐述该过程的发生机制。\
b. "时序能力状态"模型认为单个祖细胞通过系列能力窗口期依次产生不同神经元亚型，不存在命运限制性谱系（该模型已被证伪，但皮层发生期间谱系树的具体结构仍不明确）。可能情况包括：祖细胞在神经发生前即定向为独立谱系（模型2）；或某些祖细胞先产生某一谱系神经元，后期再定向至其他谱系（模型3）；祖细胞也可能保持多能性产生多种神经元（模型2和3），或逐步受限至单能状态（模型4）。CPN：胼胝体投射神经元；CThPN：皮质丘脑投射神经元；GN：颗粒神经元；SCPN：皮质下投射神经元；SVZ：脑室下区；VZ：脑室区。
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基于现有证据，可提出多种模型解释这一过程——从严格的"时序能力状态"渐进模型到直接的"单谱系定向"模型。其中，"时序能力状态"模型（Fig. 2b）与当前实验数据最不一致：该模型预测皮层发生初期不应存在谱系定向祖细胞，但事实上 Cux2 阳性放射状胶质细胞早在 E10.5 即可观察到。虽然至少存在两个明确谱系，但其关系尚未知悉——可能是完全互斥的独立谱系（model 2 in Fig. 2b），或是部分祖细胞在产生深层神经元亚型后加入 Cux2 阳性谱系从而改变能力状态（model 3 in Fig. 2b）。这一问题可通过鉴定 Cux2 阴性祖细胞特异性标记基因（如 Fezf2）并构建 FLP 敲入品系，同步追踪深层与浅层神经元谱系来验证。值得注意的是，Cux2 阳性和阴性谱系各自包含多种投射神经元亚型，尚需确定祖细胞中是否存在更精细的命运限制性亚谱系（model 4 in Fig. 2b），或某些命运决定完全发生在有丝分裂后阶段。

为简化讨论，本文假设所有浅层神经元均由 Cux2 阳性祖细胞产生，而 Cux2 阴性祖细胞构成单一谱系，但这仍是开放性问题。此外，谱系定向祖细胞的存在并不排除多能性祖细胞的可能性。随着研究的深入，预计将揭示更复杂的调控层次。

1.3 祖细胞中的位置信息

新皮层区域化起始于形态发生素（morphogens）和信号分子（signalling molecules）在新皮层原基边界的模式化中心表达。从小鼠 E9.5 开始，连合板（commissural plate）在吻内侧分泌成纤维细胞生长因子 8（FGF8）和 FGF17，而皮层缝（cortical hem）在尾内侧分泌 WNT 和骨形态发生蛋白（BMP）家族成员，抗缝（antihem）在外侧分泌 WNT 拮抗剂分泌型卷曲相关蛋白2（SFRP2）及多个表皮生长因子家族成员。这些形态发生素中，仅 FGF8 被证实具有皮层区域身份的组织者功能：通过子宫内电穿孔增加 Fgf8 表达会导致吻内侧皮层区向尾侧扩展；相反，降低肌型突变体中 Fgf8 表达降低或其受体 FGFR3C 胞内域过表达时，尾侧皮层区会向吻侧扩展。此外，在尾侧或中外侧早期异位表达 Fgf8 可导致皮层区域图谱完全复制。

这些扩散因子共同诱导 VZ 祖细胞中转录因子的梯度表达（Fig. 3a），进而调控皮层区域的相对大小和位置。Pax6 与 Emx2 在 VZ 呈吻外侧-尾内侧反向梯度表达，而 Sp8 和 Couptf1（亦称 Nr2f1）呈吻内侧-尾外侧反向梯度表达。由于这两对梯度呈正交分布，这四个转录因子（及其他待鉴定因子）的相对表达水平理论上可定义任何皮层坐标位置，使得每个有丝分裂后投射神经元离开 VZ 时即具备获得特定区域身份的基础。

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a. 大脑皮层区域化的启动源于新皮层外周对侧区域分泌的可扩散形态发生素和信号分子。这些信号诱导互补且正交的转录因子梯度表达，如 Pax6、Emx2、Sp8、Couptf1，示意图展示脑室区（VZ）平面铺片视图。\
b. Pax6 在吻外侧高表达，与尾内侧高表达的 Emx2 呈反向分布；Sp8 在吻内侧高表达，与尾外侧高表达的 Couptf1 呈反向分布。上图为整体视图，下图为矢状面视图。\
c. 位于不同内外侧和吻尾侧坐标的祖细胞特异性表达这些转录因子的特定水平，通过组合效应在 VZ 建立皮层区域命运图谱。该图谱随后转化为皮层板（CP）的明确区域图谱（平面铺片视图）。\
d. 操纵形态发生素信号或 VZ 转录因子表达会导致皮层区域大小和位置的显著改变。
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Emx2 和 Couptf1 在尾侧的高表达促进感觉皮层的特化。在 nestin-Emx2 转基因小鼠中，Emx2 在 VZ 区呈现更均匀的表达，导致视觉皮层面积扩大，同时体感和运动皮层面积缩小并向吻外侧移位。相反，当缺失一个 Emx2 等位基因时，运动皮层扩张而感觉皮层向尾内侧移位。类似地，在皮层特异性 Couptf1 条件性敲除小鼠（Couptf1$^{fl/fl}$;Emx1-Cre）中，运动皮层显著扩张占据大部分皮层区域，而感觉皮层被压缩至狭窄的枕区带状区域，但仍保持正常组织构型。

在吻侧，Pax6 和 Sp8 的表达驱动运动皮层身份的特化。Sp8 和 Pax6 条件性敲除小鼠以及 Pax6$^{Sey/Sey}$（"小眼"小鼠的突变等位基因）亚等位突变体均表现出运动皮层的严重缺失，但这些结果的解读因伴随的皮层整体缩小而变得复杂。子宫内电穿孔的功能获得与缺失实验则独立证实了 Sp8 通过两种机制调控皮层区域身份：既在新皮层祖细胞中自主性抑制 Couptf1，又通过诱导 Fgf8 产生间接效应。

虽然操纵这些转录因子梯度足以改变皮层区域的大小和位置（Fig. 3b），但异位定位区域内的神经元身份基本以正常方式建立。每个重定位区域都表达与其新身份匹配的分子标记，吸引特定模态的丘脑皮层输入，并向正确靶区发出投射。这些结果表明，祖细胞层面的调控建立了一个锚定区域身份与特定吻尾侧/内外侧位置关系的坐标系统。放射状胶质细胞和中间祖细胞中的这种命运图谱（又称"原图谱"）必须传递至其神经元后代，由第二套转录因子网络解读执行，从而指导有丝分裂后区域身份的获得。

2. 有丝分裂后亚型规范

尽管新皮层投射神经元由部分命运限制性祖细胞产生，但有丝分裂后调控对新生神经元精确亚型身份的特化同样必要。过去十年间，通过高通量方法定义新皮层层状和亚型特异性基因表达模式，已鉴定出越来越多调控亚型发育的分子机制。

2.1 SCPN 与 CThPN 亚型身份的特化

SCPN 和 CThPN 是皮质传出神经元（CFuPN）中密切相关的亚型，位于新皮层深层，在皮层发生早期依次产生。CFuPN 向 SCPN 或 CThPN 的特化具有显著可塑性：当关键调控因子缺失时，任一群体均可通过牺牲另一群体实现扩张（Fig. 4）。

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a. 有丝分裂后投射神经元的亚型身份被描述在一个理论上的 n 维"亚型空间"中——各亚型身份（由基因表达、形态学、树突结构、投射模式、电生理等特征定义）占据独特坐标。通过交叉抑制性分子调控建立的边界阻止不同亚型神经元获得彼此特征：一个边界存在于皮质下投射神经元（SCPN）与皮质丘脑投射神经元（CThPN）之间，另一个边界存在于皮质传出神经元（CFuPN）（SCPN 和/或 CThPN）与胼胝体投射神经元（CPN）之间。皮层发生早期，未分化神经元的亚型身份高度重叠（上图）；随着发育推进，亚型间差异逐渐显著（下图）。\
b. 已知分子调控构成复杂转录网络的关键节点（该网络刚被初步解析，上图）。箭头表示已确认的遗传或转录激活/抑制关系，更多相互作用和分子调控仍有待发现（下图）。\
c. 这些关键调控因子的表达变化可导致亚型边界移动，使神经元部分或完全获得其他亚型特征。某些突变体（如 Satb2 缺失（Satb2−/−）和 Sox5−/−）中，神经元会获得泛 CFuPN 身份而非明确的 CThPN 或 SCPN 身份。CFuPN 与深层/浅层 CPN 间的边界（虚线表示）可能独立移动。Couptf1 cKO：鸡卵白蛋白上游启动子转录因子 1 条件性敲除小鼠（Couptf1fl/fl;Emx1-Cre）；CTIP2, COUP-TF-interacting protein 2; FEZF2, fez family zinc finger 2; SATB2, special AT-rich sequence binding protein 2; SOX5, SRY-box containing protein 5; TBR1, T-box brain protein 1。
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锌指转录因子 FEZF2 对 SCPN 的特化至关重要。它在深层皮层生成期间表达于 VZ 祖细胞亚群和有丝分裂后 CFuPN 中（但其主要作用阶段尚未明确）。Fezf2 在 SCPN 中高表达，在 CThPN 和 subplate 神经元中低表达，而 Fezf2 敲除小鼠中：layer V 标志性大锥体神经元完全消失；SCPN 特异性基因表达缺失；无皮层神经元投射至脑干和脊髓。相反，CThPN 发育关键转录因子 TBR1 的表达扩展至推定 layer V，且许多 Tbr1 表达神经元转向丘脑投射，表明部分 SCPN 被命运转换为 CThPN（其他 SCPN 则转为 CPN，如下文所述）。因此 Fezf2 通过抑制 CThPN 身份来特化 SCPN。

除作为 SCPN 发育的"主导"调控因子外，Fezf2 还更广泛地参与 CFuPN 身份特化。Fezf2 敲除小鼠中 CThPN 和 subplate 神经元呈现紊乱状态，且包括 Ppp1r1b（亦称 Darpp32）、Tle4（亦称 Grg4）和 Foxp2 在内的 CThPN 特异性基因表达缺失。这些发现表明 CThPN 和 subplate 神经元中低水平 Fezf2 表达对其精确分化必不可少。此外，子宫内电穿孔异位表达 Fezf2 会导致 layer II/III CPN 轴突转向丘脑、脑干和脊髓等皮质下靶区。综上表明 Fezf2 决定的是 CFuPN 而非仅 SCPN 身份。

第二个转录因子 Ctip2（亦称 Bcl11b）在 Fezf2 下游调控 SCPN 的精确分化。虽然 Ctip2 缺失时 SCPN 仍能产生并正常迁移至 layer V，但其轴突生长、成束和路径寻找存在严重缺陷：大部分轴突无法到达脊髓（在中脑错误导向和解束），仅少数延伸至脑桥，无一抵达锥体交叉。尽管 Fezf2 对 Ctip2 的激活对 SCPN 发育至关重要，但 CPN、CThPN 和 subplate 发育的若干转录调控（包括 Satb2、Sox5、Couptf1）都通过抑制 Ctip2 表达发挥作用，表明 Ctip2 是新皮层投射神经元发育过程中转录调控的关键靶点。

Tbr1 基因与 Fezf2/Ctip2 拮抗作用来特化 CThPN 身份。它在有丝分裂后表达于 CThPN 和 subplate 神经元，在 Cajal-Retzius 细胞和 CPN 中低表达。Tbr1 缺失时底板形态无法辨识且底板特异性基因表达缺失。本应发育为 CThPN 的早生神经元异常高表达 Fezf2、Ctip2 及其他 SCPN 特异性基因，并将轴突导向皮质下靶区而非丘脑。Tbr1 通过直接结合高度保守的 DNA 调控区抑制 Fezf2 表达，从而至少部分通过阻止 SCPN 特化发挥作用。

2.2 对 CFuPN 亚型生成的时间控制

CFuPN 亚型在时间上重叠的发育波中产生，并共享相同的核心发育程序；然而，特定的调控机制指导着底板神经元、CThPN 和 SCPN 的顺序生成，确保每个亚型精确获得分子特征。

转录因子 SOX5 通过抑制 SCPN 相关基因（包括 Fezf2 和 Ctip2 ）的高水平表达，调控 CFuPN 亚型的有序出现，直至底板神经元和 CThPN 发育完成。SOX5 通过结合前脑 Fezf2 表达所需的增强子元件直接抑制 Fezf2。在 Sox5 基因敲除小鼠中，底板神经元异常高表达 CTIP2，错误定位于皮层浅层，并投射至大脑脚。此外，通常分别特异性表达于 CThPN 和 SCPN 的 FOG2（又称 ZFPM2）与 CTIP2 会共表达于同一群具有 SCPN/CThPN 混合特征的神经元中，表明分化过程存在缺陷。Sox5 缺失还会导致 CFuPN 广泛出现路径寻找障碍，包括 SCPN 轴突在中脑的大规模解束，以及通过外囊形成异常的皮层下投射束。通过 Golli 启动子、Fezf2 启动子驱动的绿色荧光蛋白（GFP）转基因表达，以及 Emx1-Cre 调控的 CAG-Cat-GFP 全皮层标记实验证实，皮层至丘脑的投射也严重受损。

Couptf1 抑制最晚出生、位于最表层的 CThPN 获得 SCPN 特征。在 Couptf1 缺失条件下，体感皮层 VIa 层神经元出现"运动化"异常，表现为 CTIP2 和 Fezf2 水平异常升高，但保留 TBR1 表达。虽然 Couptf1 条件敲除小鼠中更多深层神经元会向皮层下投射，但仅有 E12.5 时期提前生成、位于 VIa 层的 SCPN 轴突能到达脊髓。相比之下，E13.5 时期生成、位于 V 层的 SCPN 轴突会在进入脊髓前异常终止于脑桥。从广义上看，Couptf1 对 SCPN 亚型特征的抑制作用反映了其功能的一个新维度：通过抑制运动特征来促进感觉特征的建立。

2.3 CFuPN 和 CPN 亚型身份的描述

CFuPN 与 CPN，尤其是深层 CPN 共享发育边界，二者在相同时间窗口产生，并在皮层 V 层和 VI 层中相互混杂分布。从轴突离开皮层板开始，CFuPN 与 CPN 便遵循截然不同的投射路径：前者远离皮层，后者朝向中线。因此，对这两类神经元发育的关键调控主要通过抑制促使其向另一种命运分化的分子程序来实现（Fig. 4）。

如前所述，Fezf2 是决定 CFuPN 身份的核心因子，其功能需要抑制 CPN 命运。体内过表达 Fezf2 足以使浅层 CPN 的轴突重定向至皮层下靶区。当 Fezf2 缺失时，从 Fezf2 基因位点表达碱性磷酸酶的神经元会将轴突延伸至胼胝体。此外，V 层中更多神经元表现出 CPN 特有的电生理特征并表达 CPN 特异性基因，提示大量 SCPN 被命运转换为 CPN。值得注意的是，这些神经元似乎获得了深层 CPN 的特征——表达 SATB2、Lpl 等广谱 CPN 标志基因，但不表达 Inhba、Limch1 等浅层 CPN 特异性基因。

转录因子 SATB2 是 CPN 命运决定及 CFuPN 命运抑制的必要条件。Satb2 在皮层各层 CPN（可能还包括联合神经元）中高表达。Satb2 缺失时，尽管大脑中线结构形成正常，但几乎无轴突跨越胼胝体。相反，从Satb2 基因位点表达 lacZ 的神经元会向脑干和脊髓投射。Satb2 敲除小鼠中，Cdh10、Dkk3、Sip1、Cux1等 CPN 特征基因表达缺失或显著降低；而浅层神经元却异常高表达 Ctip2 及 Clim1（又称Ldb2）、Cdh13、Grb14 等 SCPN 特征基因。Satb2 通过直接抑制 Ctip2（而非通过上游调控 Fezf2）发挥作用，因此 Satb2 缺失的 CPN 并未完全命运转换为 SCPN。最近研究发现，转录共调节因子 SKI（ski 肉瘤病毒癌基因同源物）是 SATB2 招募抑制复合体的关键组分，可启动组蛋白去乙酰化酶 1 依赖的染色质重塑。SKI 敲除小鼠的表型与 Satb2 敲除小鼠高度相似。

2.4 亚型规范的上位分析

多项研究表明，决定神经元亚型特征的转录因子会相互直接抑制，这提示它们的主要功能可能并非主动指定特定命运，而是通过抑制其他命运的分化程序来实现调控。根据这一模型，若同时敲除两个相互竞争的转录因子（如 Tbr1 与 Fezf2，或 Satb2 与 Ctip2），可能部分恢复正常的亚型特化。实验证据支持这一假说：在 Tbr1 和 Fezf2 双敲除小鼠中，虽然向丘脑的投射（Tbr1 单敲除时完全缺失）仍未恢复，但皮层脊髓束（Fezf2 单敲除时完全消失）的形成得到了部分挽救。类似地，Satb2 与 Ctip2 双敲除小鼠中，胼胝体（Satb2 单敲除时无法形成）的发育也获得部分修复。这些结果表明：只要竞争性调控被消除，即使缺失关键命运决定因子，下游程序仍能引导部分神经元进行适当分化。

2.5 亚型身份的逐步完善

成熟的深层神经元虽然最终表现出显著差异的基因表达模式和轴突投射路径，但这些差异中有部分是在有丝分裂后经过数日精细调控才逐渐显现的。新完成有丝分裂的神经元通常广泛共表达多种转录因子，这些因子后期会限定于不同亚型。例如在 E12.5 至 E14.5 期间，皮层板神经元会同时高表达 CTIP2 与 TBR1/FOG2，随后随时间推移分别限定为 SCPN 和 CThPN 特征。类似地，E13.5 时深层神经元会短暂共表达 CTIP2 与SATB2，后期则分别限定为 SCPN 和 CPN 特征。这种深层神经元共表达多亚型调控因子的时期，可能对应着亚型身份决定的关键可塑性窗口。这种互斥亚型调控因子的初始广泛共表达现象尤为有趣，特别是考虑到近期关于神经前体细胞命运早定论的研究证据。

作者认为，命运决定的时机可能与具有生物学意义的关键节点相关：部分命运决定可能倾向于在前体细胞阶段完成，而另一些则可能在有丝分裂后阶段最终确立（见 Box2）。CFuPN 与深层 CPN 在迁移通过中间带时就开始朝不同方向延伸轴突，因此这两大类命运的决定可能需要在前体细胞阶段完成。相比之下，CThPN 与 SCPN 的轴突会在内囊中共同行进数日后才分道扬镳。这一时期恰好与新完成迁移的 CFuPN 从共表达高水平 TBR1/CTIP2 向选择性表达其中一种因子的转变过程重合，可能反映了有丝分裂后的命运决定机制。

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作者提出，投射神经元身份特化的时序性与剂量依赖性特征可采用一阶布尔逻辑进行形式化描述，其中决策点以"分子逻辑门"形式呈现。下文以皮层下投`射神经元（SCPN）作为典型范例，图解这种描述特定投射神经元亚型发育轨迹的方法（见图解）。

新皮层区域的建立依赖于组合作用的转录因子，这些因子通过抑制腹侧端脑程序（Pax6、Emx2、Sox6）及皮层缘程序（如 Lhx2、Foxg1）来实现。随后，新皮层前体细胞通过尚未完全阐明的分子调控机制，被进一步特化为至少两种部分命运受限的谱系：Cux2- Fezf2+ 的 CFuPN，而 Cux2+ 前体则产生 CPN 和其他浅层神经元。CFuPN 在 Fezf2（决定 SCPN 特化）与 Tbr1 及 Sox5（决定皮层丘脑投射神经元 CThPN 特化）的交叉抑制所形成的分子逻辑门处完成特定亚型命运决定。一旦 SCPN 被特化，Ctip2 将促进后续分化步骤，包括轴突延伸、成束和靶向生长。其他调控因子（如 Otx1 和 Lmo4）则指导 SCPN 亚群的进一步特化，包括侧支形成和修剪等过程。

上述每个连续的决策点都由多个转录调控因子和染色质修饰蛋白的协同活动所控制，这些蛋白驱动细胞转录组和表观遗传状态的广泛改变。虽然作者仅讨论了亚型特化的调控机制，但神经元发育的其他方面（如区域特化和迁移）也同步进行，并由部分交叉的分子程序协调完成。
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3. 投射神经元特化

有丝分裂后调控因子将神经前体细胞继承的位置信息连续梯度转化为精确的脑区边界，指导感觉图谱的形成，并引导投射神经元获得与脑区相适应的表型特征（Fig. 5）。其中两个关键调控因子——LIM域蛋白4（Lmo4）和含碱性螺旋-环-螺旋结构域蛋白B5（Bhlhb5，又称 Bhlhe22）以互补模式表达，对确立脑区间分子边界的精确定位至关重要。

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Bhlhb5 或 Lmo4 的功能缺失会全面影响有丝分裂后脑区身份特化的多个方面，包括初级感觉皮层（S1）桶状区的基因表达、投射模式和细胞组织结构。\
a. 出生后第 7 天，Bhlhb5 在 S1、初级听觉皮层（A1）和初级视觉皮层（V1）表达，而 Lmo4 在初级运动皮层（M1）表达并被排除在初级感觉区外。\
b. 在 Bhlhb5 缺失条件下（中排），感觉区的分子特征受损：例如钙黏蛋白8（Cdh8）异常扩张至本应排除的 S1 区。脑区特异性投射模式发生改变——尾侧运动皮层的皮层脊髓运动神经元（红色）无法抵达脊髓。丘脑皮层轴突（通过5-羟色胺免疫染色显示）在 Bhlhb5 敲除小鼠中支配范围扩大，且无法形成清晰的皮层桶状结构（尼氏染色显示）。反之，在 Lmo4 缺失条件下（后排），运动区的分子特征受损，Cdh8 等基因在运动区的表达降低。运动皮层神经元出现异常特化（蓝色），无法形成逆向侧支投射。虽然尚未通过尼氏染色观察皮层细胞构筑，但 Lmo4 条件性敲除突变体中丘脑皮层轴突的支配范围明显缩小。
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LMO4 是一种有丝分裂后表达的转录因子，在运动皮层和高阶感觉区特异性表达，但在初级躯体感觉皮层、视觉皮层和听觉皮层中被选择性排除（Fig. 5）。Lmo4 条件性功能缺失会导致躯体感觉特异性基因向吻侧轻微扩张，同时运动特异性基因表达受限，但这些缺陷并未造成脑区身份识别的严重障碍。此外，单个桶状结构的边界变得模糊，整体触须桶状区范围略有缩小。Lmo4 调控运动皮层区域特异性输出连接的多个方面，包括部分 CPN 和 SCPN（逆向投射神经元）向尾侧发出的侧支延伸，以及吻侧运动皮层中脑干投射与脊髓投射 SCPN 的比例。

碱性螺旋-环-螺旋转录因子 Bhlhb5 最初在皮层板呈尾内侧高、吻外侧低的梯度表达，随后逐渐限定于初级感觉区（躯体感觉、视觉和听觉区）。Bhlhb5 缺失时，躯体感觉皮层和尾侧运动皮层的分子区域特征广泛紊乱，Lmo4 等区域特异性基因出现异常表达。虽然桶状区的位置和构型未变，但丘脑皮层输入变得弥散，触须桶状区的细胞构筑组织仅能模糊辨认。因此，Bhlhb5 对躯体感觉皮层标志性特征（包括特定基因表达和触须桶状区的精确细胞组织）的形成具有核心作用。

其他多个转录调控因子也参与有丝分裂后脑区身份的特化。前文所述的 CThPN 亚型决定因子 Tbr1 同样影响脑区特征获取——该因子在皮层吻侧区域高表达，其功能缺失会导致原本局限于尾侧皮层的基因向吻侧扩张。值得注意的是，基因表达异常并不局限于 VI 层，提示浅层神经元中短暂或低水平的 Tbr1 表达也对脑区特化具有指导作用。同源域转录因子正齿状同源异型盒1（OTX1）是 SCPN 建立区域特异性连接的必要因子：该蛋白在脑室区前体细胞中存在于胞质，后期转位至 CThPN 和 SCPN 的细胞核（核转位发生在出生后第一周）。虽然 Otx1 在全皮层均匀表达，但其功能缺失选择性影响视觉皮层 SCPN——这些神经元异常保留脊髓投射，最终形成本该仅见于运动皮层 SCPN 的连接模式。最后，前体细胞阶段脑区化调控关键因子 Couptf1 也在有丝分裂后继续表达，但目前尚不清楚其是否仅通过前体细胞功能调控脑区特异性基因表达和投射模式发育，还是在有丝分裂后神经元中仍持续发挥作用。

这些关于关键有丝分裂后调控因子表达与功能的新发现，正逐步揭示脑区身份获取的分子逻辑。例如，皮层被 Bhlhb5 和 Lmo4 划分为两大功能域的现象提示：一个共同程序调控初级感觉区发育，而对立程序则支配其他区域（包括高阶感觉区和运动区）的特征形成。最新证据表明，初级与高阶感觉区独特基因表达谱的形成需要丘脑皮层输入，提示外在因素对皮层区域模式化的后期阶段至关重要。总体而言，目前仅发现少量调控有丝分裂后脑区特化的因子，更多重要调控机制仍有待揭示。

4. 整合亚型和区域身份

早期神经解剖学家首次对新皮层进行分区分类，是基于层状形态、细胞密度和厚度等方面的区域差异。这些细胞构筑差异反映了一个区域是专门用于输入、输出还是整合功能，源于分化为 CThPN、SCPN、第 IV 层颗粒神经元或 CPN 的神经元相对比例的变化。因此，区域特化不仅需要建立特定的输入和输出连接，还需要产生特定比例的投射神经元亚型。

最新研究表明，某些转录因子协调调控神经元亚型和脑区特化。如前所述，Tbr1 和 Couptf1 既是 CFuPN 特化的重要调控因子，又分别促进运动和感觉脑区特征的形成。类似地，转录因子 AP2γ（激活增强子结合蛋白2γ）通过调控枕叶皮层中 Tbr2 阳性中间前体细胞的数量，以区域特异性方式控制浅层 CPN 的生成数量。这些发现为早期关于灵长类动物不同皮层区域前体细胞周期动力学存在差异的报道提供了初步的机制解释。

5. 解密的新皮质进化

在皮层演化过程中，径向和切向扩展伴随着神经元多样化和区域特化，既增强了皮层环路的复杂性，又催生了越来越多功能特化的脑区。有假说认为，羊膜动物祖先的背侧端脑（类似现代蜥形类）仅含有皮层下投射神经元，并被分为两大功能区域。虽然哺乳动物谱系保留了这一基本结构，但还进化出了专门用于接收处理输入以及半球内外信息整合的新神经元亚型。此外，特定认知功能被区隔成界限分明的初级、次级和高阶运动/感觉区。

中间前体细胞的出现促进了哺乳动物皮层厚度的增加和投射神经元多样性的扩展，这类细胞在蜥形类中并不存在。这些过渡性扩增细胞形成了额外的生发区——脑室下区（SVZ），为新皮层各层提供神经元，使皮层生发带的神经发生能力呈指数级增长。在灵长类等具有发达皮层的哺乳动物（如雪貂）中，SVZ 进一步分化为内、外两个亚区。虽然小鼠不具有分区的 SVZ，但仍存在外放射状胶质样细胞，提示灵长类高度组织化的外 SVZ 可能是对原有前体细胞群的扩展。SVZ 的出现可能促成了六层哺乳动物新皮层的形成，以及包括 CPN 在内的新皮层神经元亚型的产生。

CPN 是胎盘类哺乳动物的演化创新，已成为真兽类中最丰富多样的皮层投射神经元。该群体在啮齿类中已显著扩张和分化，在灵长类中更为突出。位于不同皮层层（甚至亚层）的 CPN 具有显著差异的基因表达模式，表明 CPN 亚群已分化出特定功能。与"CPN源于既有皮层传出神经元群体"的假说一致，SATB2 对 CFuPN 程序的抑制对胼胝体投射的形成绝对必要。但调控 CPN 亚群分化的更多分子机制仍有待发现。

祖先羊膜动物的脑区布局被认为由紧邻初级视觉区的感觉运动区构成（类似现代蜥形类）。在胎盘哺乳动物中，祖先感觉运动区已分化为独立的初级躯体感觉区和运动区，而初级视觉皮层与初级感觉皮层之间因新增大量次级和高阶感觉区而彼此分离。这些区域均以 Lmo4 表达为标志，提示 Bhlhb5 与 Lmo4 的互补表达模式反映了哺乳动物脑区布局这两部分的差异化演化起源。值得注意的是，Lmo4 在人类中可能进一步特化——其在人类胚胎左右半球的差异表达可能介导了皮层半球间的不对称性。

总之，现有证据支持这样的演化模型：在进化历程中，越来越多的转录因子被逐步招募来调控皮层发育，在简单祖先框架上逐渐叠加神经元多样性和区域特化的层级。皮层演化既涉及新神经元亚型的创新（如CPN），也包含既有亚型（如 CFuPN）的多样化，这些变化共同塑造了哺乳动物新皮层的复杂结构与功能。

6. 观点

6.1 对疾病和修复的影响

皮层发育研究揭示的重要遗传决定因子，可能为神经退行性疾病提供机制性解释。例如，最近对肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型 hSOD1G93A 小鼠的研究发现，不仅皮层脊髓运动神经元广泛退化，通过亚型特异性发育调控基因鉴定出的 SCPN 群体也普遍受损。这表明人类 ALS 的非运动症状可能源于多皮层区域 SCPN 的退化。未来研究可探索决定 SCPN 退化易感性的发育相关因子，或为 ALS 治疗提供新靶点。

神经元亚群的发育轨迹还有助于解析病理表现不同的相关神经退行疾病。皮层运动输出进行性丧失是原发性侧索硬化（PLS）和遗传性痉挛性截瘫（HSP）的共同特征，但两类疾病中 SCPN 的受累模式存在差异：PLS 患者投射至延髓、颈段、胸段和腰段的 SCPN 广泛退化，导致随意肌进行性无力；而 HSP 则选择性损伤腰段投射的皮层脊髓运动神经元，主要表现为行走困难。这种亚群特异性退化的分子基础尚不清楚，可能与特定皮层区域 SCPN 的遗传决定因子有关——这些神经元靶向脑干和脊髓的不同头尾节段。

对神经元亚型特异性分化分子调控的更深入理解，还能为神经系统修复提供新策略。事实上，发育生物学知识已被应用于体外系统——通过形态发生素信号引导胚胎干细胞分化为新皮层前体细胞。这些前体可产生异质性神经元群体，在移植后能向多种靶区投射轴突并整合入宿主皮层环路。未来研究或可利用新发现的发育调控机制，将胚胎干细胞源性前体大规模定向分化为特定神经元亚型。其中，Fezf2 等"主导"调控因子尤其值得关注：该因子不仅在体内能编程和重编程神经元亚型特征，也有望指导体外胚胎干细胞分化。

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