Scanpy 分析 scRNA-seq：降维与聚类

引言

本系列讲解 使用Scanpy分析单细胞（scRNA-seq）数据 教程，持续更新，欢迎关注，转发！

归一化

接下来的预处理步骤是归一化。一种常用的方法是先进行计数深度缩放，然后进行对数加一（log1p）转换。计数深度缩放是将数据标准化到一个“尺寸因子”，比如数据集中所有样本的中位数计数深度、每万（CP10k）或每百万（CPM）计数。通过调整 pp.normalize_total 中的 target_sum 参数，可以控制计数深度缩放的尺寸因子。采用中位数计数深度进行归一化，并结合 log1p 转换（也就是 log1PF）来处理数据。

# Saving count data
adata.layers["counts"] = adata.X.copy()

# Normalizing to median total counts
sc.pp.normalize_total(adata)
# Logarithmize the data
sc.pp.log1p(adata)

特征选择

接下来，希望减少数据集的复杂性，只保留那些最有信息量的基因。这个过程通常被称为特征选择。scanpy 的 pp.highly_variable_genes 函数会根据所选的方法，来识别出高变基因。

sc.pp.highly_variable_genes(adata, n_top_genes=2000, batch_key="sample")

sc.pl.highly_variable_genes(adata)

降维

通过主成分分析（PCA）来降低数据的维度。PCA 可以揭示数据中主要的变化方向，并去除噪声。

sc.tl.pca(adata)

可以检查每个主成分对数据总方差的贡献，从而判断在计算细胞之间的相似性（例如用于聚类分析的 leiden() 或 tsne() 函数）时，应该考虑多少主成分。根据的经验，即使多选一些主成分，也不会有明显的负面影响。

sc.pl.pca_variance_ratio(adata, n_pcs=50, log=True)

此外，还可以绘制主成分图，看看是否有某些不期望的因素（比如批次效应或质量控制指标）在数据中导致了显著的变异。虽然在这个案例中没有发现特别严重的问题，但进行这样的探索还是很有必要的。

sc.pl.pca(
    adata,
    color=["sample", "sample", "pct_counts_mt", "pct_counts_mt"],
    dimensions=[(0, 1), (2, 3), (0, 1), (2, 3)],
    ncols=2,
    size=2,
)

最近邻图的构建和可视化

利用数据矩阵的主成分分析（PCA）结果来构建细胞的邻域图。

sc.pp.neighbors(adata)

接着，通过 UMAP，将该图映射到二维空间中，以便进行可视化展示：

sc.tl.umap(adata)

现在，可以根据样本类型对 UMAP 图进行可视化处理。

sc.pl.umap(
    adata,
    color="sample",
    # Setting a smaller point size to get prevent overlap
    size=2,
)

虽然本教程涉及的数据包含了两个不同的样本，但发现它们之间的批次效应非常小，因此可以继续对数据进行聚类分析和注释。

如果你在 UMAP 图中发现了批次效应，那么进行跨样本整合以及批次校正或整合可能会有所帮助。建议你可以参考 scanorama 和 scvi-tools 这两个工具来进行批次整合。

聚类

和 Seurat 以及其他许多分析框架一样，推荐使用 Leiden 图聚类方法。需要注意的是，Leiden 聚类是直接对细胞的邻域图进行操作的，而这个邻域图已经在前面的步骤中计算完成了。

# Using the igraph implementation and a fixed number of iterations can be significantly faster, especially for larger datasets
sc.tl.leiden(adata, flavor="igraph", n_iterations=2)

sc.pl.umap(adata, color=["leiden"])

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