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用k-mer分析进行基因组调查:(一)基本原理

枝叶

(全文5058字)

【推荐】用Smudgeplot评估物种倍性后,用组合jellyfish+GenomeScope1.0做二倍体物种的基因组调查,用组合KMC+GenomeScope2.0做多倍体物种的基因组调查。

1. 基因组调查(genome survey)

1.1. 基因组调查

基因组调查(genome survey)指基因组特征评估,一般指通过k-mer分析二代测序数据,获得基因组大小(genome size),杂合度(heterozygosity),重复序列比例,GC含量等基因组信息的手段。

  1. 基因组调查介绍

    在无参考基因组的情况下,使用中低深度的短片段测序所得的reads进行基因组调查(genome survey),初步评估基因组特征,包括基因组大小(genome size),杂合度(heterozygosity),重复序列比例,GC含量等,从而为后续的基因组测序、组装和结构注释方案提供参考依据。

  2. 基因组调查的目的

    基因组调查主要目的是获取两个方面的信息,一个是基因组的大小,一个是基因组复杂程度。

  • 基因组大小(genome size)

    因为测序费用是以测序量为单价计算,所以基因组越大,测序费用越高。

  • 基因组复杂程度

    基因组越复杂(杂合度越高,重复序列占比越高),意味着测序难度和组装难度越大。

  1. 基因组调查实践
  2. 为了准确估计基因组信息,建议测序深度为50X(即预估基因组大小的50倍),最小也不低于25X。
  3. 做基因组调查和后续做基因组denovo测序需要使用同一个个体,因为有些物种个体间的基因组特征有较大的差异,且同一个个体做survey的illumina数据可用于组装。
  4. 预估基因组大小可以通过已有研究粗略判断,包括流式细胞研究,近缘种研究,也推荐植物在C值数据库网站里查询。
  5. 基因组调查(genome survey)常常使用k-mer分析来实现。

1.2. 基因组复杂程度

基因组复杂程序的判断标准包括:基因组大小,倍性,杂合度,重复序列比例,GC含量等。

一般而言,基因组越大,重复序列比例越高; GC含量异常低或异常高,重复序列比例也会很高;多倍体基因组的杂合度高于二倍体。

判断基因组复杂程度可以参考以下经验性标准:

  • 简单基因组: 单倍体;或纯合二倍体;或杂合度低于0.5%, 且重复序列低于50%, 且GC含量在35%-65%的二倍体。
  • 复杂基因组: 杂合度在0.5%~1.2%之间,或重复序列高于50%,或GC含量异常(<35%或>65%)的二倍体,或者多倍体。
  • 高复杂基因组: 杂合度>1.2%;或重复序列占比大于65%。

2. k-mer分析

k-mer分析可以用在生物信息学许多方面,这篇博客的k-mer分析特指用于基因组调查的k-mer分析方法。

2.1. k-mer相关概念

  1. monomeric unit (mer)

    单体单元,单位是nt或者bp。

    通常用于双链核酸中的单位,100 mer DNA相当于每一条链有100nt,那么整条链就是100bp。

  2. k-mer概念

    在生物信息学中,k-mer是指包含在一段序列中的长度为k的子串。

    一段长度为L的核酸序列,以一个碱基为步长滑动,一共可以生成(L-K+1)个k-mers。

    另外还可以用这段核酸的反向互补序列再生成一次k-mer。

omics_genome.survey_Kmer

Figure 1. k-mer示例。图片来源:https://cloud.tencent.com/dev...

2.2. k-mer分析步骤

  1. 通过切割二代测序的reads为k-mers
  2. 统计k-mer的总数和每一种k-mer的频数
  3. 绘制k-mer的频数分布图
  4. 根据k-mer的频数分布的主峰峰值判定k-mer的期望深度(即主峰对应的k-mer频数)。
  5. 根据k-mer的期望深度和k-mer的总数估计基因组大小。
  6. 根据低频k-mer估计数据错误率,并修正基因组大小的估计。
  7. 根据k-mer的其他峰估计k-mer的杂合度和重复序列比例。

2.3. k-mer原理

k-mer分析应用的前提假设是测序的reads是随机分布在基因组上的。

首先定义几个变量,方便解释原理:

  • 基因组大小:G
  • read读长:L
  • reads总条数:n
  • k-mer长度:K

2.3.1. 碱基深度分布

  1. 单条read测序覆盖到某一个碱基的概率:$L/G$。
  2. 因为$L/G$很小,n很大,每个碱基覆盖深度服从泊松分布。
  3. 则每个碱基的覆盖深度的期望为:$d=(L/G)*n$。

2.3.2. k-mer深度分布

  1. 一个大小为G的基因组可以产生的k-mer种类约为G。

    • 假设一个基因组产生的K都是unique的,从一个大小为G的基因组可以得到$(G-K+1)$种不同的k-mer。
    • 一般而言,基因组大小G在几百Mb或者Gb为单位,远大于K和1,所以K和1可以忽略不计,约等于G种k-mer。
  2. 单条read测序完全覆盖某种k-mer的概率:$(L-K+1)/G$。

    • k-mer种类的总数约为G
    • 单条read能产生的k-mer种类数量为$(L-K+1)$
    • 假设read随机分布在基因组上,单条read测序完全覆盖某种k-mer的概率就为:$(L-K+1)/G$
  3. 同样因为$(L-K+1)/G$很小,n很大,每种k-mer的覆盖深度服从泊松分布。
  4. 每种k-mer的覆盖深度的期望为:$D=((L-K+1)/G)*n$。
  5. 由此可以得到,基因组大小为:$G=(L-K+1)*n/D$。

2.3.3. 基因组大小

  1. 计算总k-mer个数N和k-mer期望深度D。

    • 对测序reads进行k-mer分割,获得总k-mer个数N。
    • 统计所有分割的k-mer,绘制频数分布图。
    • 理想情况下(不考虑测序错误、序列重复性和杂合序列的条件下),k-mer的频数分布遵循泊松分布,可以将频数分布峰值的k-mer频数作为k-mer的期望深度D。
  2. 通过下面公式可知,基因组大小G=N/D。

    • k-mer的总数量$N=(L-K+1)*n$
    • k-mer的期望深度$D=((L-K+1)/G)*n$

    只要通过k-mer分析计算得到k-mer的总数量N和k-mer的期望深度D,则可以算出基因组大小G。

2.3.4. 基因组调查

在不考虑测序错误、序列重复性和杂合序列的条件下,k-mer的深度分布遵循泊松分布。但实际情况是三者都存在,所以需要计算错误率,重复序列占比和杂合度,并根据计算结果修正对基因组大小的估计。

错误率
  • 测序错误:一般认为低频k-mer(K=1,2...)是测序错误引起的,去除低频k-mer并计算错误率以修正基因组大小的估计。
  • 一般把拐点前的低频k-mer当作错误去除。
重复序列占比
  • 基因组中存在的重复序列会使对应的k-mer频数高于k-mer期望深度D。
  • 在k-mer频数分布图中重复序列对应的k-mer会表现为频数大于主峰的一个重复峰。
  • 根据主峰右侧的重复峰可以估计基因组的重复序列比例。

    • 通过模型计算一个阈值,比如阈值为1.6倍主峰,理论上单拷贝序列(非重复序列)出现在1.6倍主峰右边的概率很低,可以把1.6倍主峰之后的看作重复k-mer。
    • 统计重复k-mer的总数量m,从而可以算出:重复序列的大小R=重复k-mer的总数量m/k-mer的期望深度D。
    • R/G即为重复序列占基因组的比例。
杂合度
  • 基因组中存在的杂合序列会对应两种类型的k-mer,并使得这些k-mer频数低于k-mer期望深度D。
  • 假设两种k-mer数量大致相等,在k-mer频数分布图中杂合序列对应的k-mer会表现为频数约为主峰一半的一个杂合峰。
  • 根据主峰左侧的杂合峰可以估计基因组的杂合度。

    • 假设基因组中的杂合率为 h(每个碱基为杂合点的概率),一个k-mer是纯合k-mer的概率为 $P1 = (1-h)^k$, 则是杂合的概率 $P2 = 1-P1 = 1-(1-h)^k$。
    • 假设产生的k-mer种类的总数为M,其中属于单拷贝序列(非重复序列)的k-mer种类。
    • 在二倍体中,单拷贝序列(非重复序列)的同源区域,会产生 U×P2 的杂合k-mer,这个数是可以通过计算得到的:只要统计非重复k-mer的总数 M , M-U即为产生的杂合k-mer数。则 $M-U = U×P2 = U×(1-(1-h)^k)$。
    • 通过计算,即可通过M和U的值得到基因组的杂合率h。

在实际应用过程中,估计了基因组的错误率、杂合度和重复序列比例后,重新修正基因组大小的估计,从而得到基因组调查的结果。

omics_genome.survey_GenomeScope1.0

Figure 2. k-mer分析(软件GenomeScope)结果示例

2.4. k-mer用途

许多分析都会用到k-mer的处理方法,把测序得到的reads通过截取k-mer后用于分析。

比如评估基因组特征,组装基因组,物种样品污染评估等。评估基因组特征(genome survey)包括评估基因组大小(size),杂合度,重复序列比例等。

  1. 组装基因组

    组装基因组使用k-mer的目的主要是去除低频率的k-mer以提高组装结果准确性。

  2. 评估基因组大小(size)

    在不考虑测序错误、序列重复性的条件下,k-mer的深度分布遵循泊松分布,可以将深度分布曲线的峰值作为期望测序深度。

    在k-mer原理部分解释了用k-mer评估基因组大小的公式:

$$基因组大小G=总k-mer数量N/k-mer期望深度D$$

  1. 评估基因组杂合度
    根据k-mer频数分布图的杂合峰,可以估计基因组的杂合度。
  2. 评估基因组重复序列比例

    根据k-mer频数分布图的重复峰,可以估计基因组的重复序列比例。

  3. 评估物种样品污染

    根据k-mer频数分布图,可以评估测序样品污染情况。

    • 如果k-mer频数分布图出现两个明显的峰,但两个峰的横坐标又不是二倍关系,那就可能是DNA污染导致的。
    • 因为一个物种的杂合峰的频数约为主峰的一半,重复峰的频数约为主峰的两倍。
    • 如果DNA中存在两个物种的样品(即有污染),期望会出现对应的两个峰,且两个峰的横坐标之间也非两倍的关系,由此可以初步判定该测序样本存在污染。
    • 至于具体是因为什么物种造成污染,则可以通过blast比对nr库进行简单的判断。

    除了通过k-mer频数分布评估DNA样品的污染程度外,还可以通过GC含量分布图判断,查看图中是否存在多个密度集中的类群。

2.5. k-mer的优势和局限

  1. 增加准确率

    • 二代测序的准确率已达到99.9%,但测序量非常大时,错误碱基的绝对数量(比如10亿碱基里错误碱基数量会达到1000万个)还是会对分析有很大的影响。
    • 由于测序错误具有随机性,通过将reads切割产生的k-mer中,测序错误生成的k-mer绝大多数都是测序物种中不存在的k-mer,因此都只出现1次(或很少的几次),要是将这些低频的k-mer去掉,就有较大可能去除测序错误,从而使得分析(基因组调查,组装基因组)结果更可靠。
  2. 不适用过于复杂的基因组

    • k-mer分析适用于分析唯一主峰区域所占比例较大的简单基因组。
    • 当基因组杂合非常高或者重复序列比例非常大时,其影响可能导致无法通过k-mer分析正确估计基因组大小。

2.6. k-mer的选择

2.6.1 k-mer的大小选择

  1. K应该足够大到k-mer可以映射到基因组的唯一位置。
  2. 太大的k-mer会降低去除低频k-mer代表的错误碱基的概率(增加错误率),也会降低k-mer深度(使得k-mer频数分布的峰不明显),而且大的k-mer会增加计算资源的使用。
  3. 基因组调查一般选17,21比较常见。

2.6.2 选择k-mer的考虑

  1. k-mer只能是奇数?

    • 把k-mer设置成奇数是为了防止通过k-mer组装时,正反链混淆。
    • 偶数的k-mer的反向互补序列常常与自身一样,从而组装k-mer时会混淆正反链的组装,奇数的k-mer就不存在这个问题。
  2. k-mer的长度代表了可能存在的k-mer种类的数量(4的K次方),越长的k-mer片段映射的物种特异性越强。基因组越大,需要的k-mer越长。
  3. 当基因组中有较多重复序列时,可以用较大的k-mer来跨过高重复的区域,从而获得更加准确及完整的基因组草图;
  4. 由于reads上的碱基错误率的存在,选择较长的k-mer会带来较高的错误率,这也可以加大测序深度来弥补。
  5. 如果是用于组装基因组,为了得到更加完整的基因组,要尽可能使用较长的k-mer用于组装。

3. k-mer分析软件

3.1. k-mer分析软件简介

k-mer分析分为k-mer频数统计基因组特征评估两步。此外,Smudgeplot还可以用k-mer分析评估物种的倍性。

  1. jellyfish

    • jellyfish可以实现第一步k-mer频数统计。
    • 特点是使用Hash表存储数据,能多线程运行;速度快,内存消耗小。
  2. KMC

    • KMC可以实现第一步k-mer频数统计。
  3. GenomeScope

    • GenomeScope可以实现第二步,利用k-mer频数统计结果进行基因组特征评估。
    • 1.0版本用于二倍体物种,2.0版本用于多倍体物种。
  4. KAT(The k-mer Analysis Toolkit)

    • KAT(The k-mer Analysis Toolkit)可以实现k-mer频数统计和基因组特征评估两步。
    • 包含多个工具来帮助用户通过使用k-mer对测序数据进行简单分析,如组装完整性、测序错误、是否有污染等。
  5. GCE

    • GCE可以分别实现k-mer频数统计和基因组特征评估两步。
  6. KmerGenie

    • KmerGenie可以同时实现k-mer频数统计和基因组特征评估两步。
    • 最大优点在于可以实现在多个预设k-mer下的自动分析,除了进行常规的k-mer频数统计之外,还能够基于不同k-mer自动计算基因组大小,并为基因组组装评估一个最佳组装k-mer数值作为备选。

3.2. 一些使用软件的经验总结

  • 【推荐】用Smudgeplot评估物种倍性后,用组合jellyfish+GenomeScope1.0做二倍体物种的基因组调查,用组合KMC+GenomeScope2.0做多倍体物种的基因组调查。
  • k-mer长度常用17/21。
  • 软件KmerGenie,GCE和jellyfish获取的频数分布表,都可用于软件genomescope和GCE第二步骤的分析。
  • 由于老版本的GCE第一步骤支持的最大k-mer频数为255,大于255的数据被合并(新版本GCE好像更新了,目前没有这个限制了);而jellyfish统计到10000行,预估结果会更为准确。
  • GenomeScope对于高重复序列的基因组统计的基因组大小会偏小,建议max kmer coverage设置大一点,大于等于10000。
  • 有些软件(比如GCE)有另一个参数需注意和设定,单倍体模式还是杂合模式,可以两种模式都分析,查看差别。
  • 实践经验发现,k-mer值设置得越高,估计出来的基因组size会越大;
  • 另外,在jellyfish里的jellyfish histo统计频数分布时,用参数-h 10000把统计上限调高,以及在GenomeScope阶段,Max kmer coverage设置的大一些(即统计进的kmer数量越多),估算出来的基因组大小也会略大一些。

4. references

  1. wiki_k-mer: https://en.wikipedia.org/wiki...
  2. genome survey:https://xuzhougeng.top/archiv...
  3. xuzhougeng's blog:https://www.jianshu.com/p/85d...
  4. k-mer与基因组组装:https://cloud.tencent.com/dev...
  5. k-mer分析和原理:https://www.bbsmax.com/A/lk5a...
  6. jellyfish paper:https://academic.oup.com/bioi...
  7. jellyfish github:https://github.com/gmarcais/J...
  8. GenomeScope1.0 github:https://github.com/schatzlab/...
  9. KAT github:https://github.com/TGAC/KAT
  10. GCE github:https://github.com/fanagislab...
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