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用k-mer分析进行基因组调查:(二)用jellyfish进行k-mer频数统计

枝叶

(全文约1520字)

【推荐】用Smudgeplot评估物种倍性后,用组合jellyfish+GenomeScope1.0做二倍体物种的基因组调查,用组合KMC+GenomeScope2.0做多倍体物种的基因组调查。

1. k-mer进行基因组调查的软件

k-mer进行基因组调查分为k-mer频数统计基因组特征评估两步。

  • jellyfish可以实现第一步k-mer频数统计。
  • jellyfish的结果sample.histo可以用在GenomeScope上,实现第二步基因组特征评估。

2. jellyfish 简介

jellyfish是Center for Bioinformatics and Computational Biology在2011年研发的一款对DNA的k-mers计数的软件,用Hash表储存数据,能多线程运行。

3. jellyfish 安装

  1. conda安装
  2. conda install -c bioconda jellyfish #安装的是v2.2.10
  3. github安装
  4. github:jellyfish上通过源码安装。

4. jellyfish 运行

一般先用jellyfish count进行k-mer计数,然后用jellyfish histo对结果进行统计,获得k-mer的频数分布直方表sample.histo。

4.1. count —— k-mer计数

  1. 命令

jellyfish count -m 17 -s 10G -t 12 -C -o sample.jf <(zcat sample_1.fq.gz) <(zcat sample_2.fq.gz)

  1. 参数
  2. sample_1.clean.fq sample_2.clean.fq

    使用的PE reads,不支持压缩格式*.fq.gz输入文件,如果不解压缩,也可以用<(zcat sample_1.fq.gz) <(zcat sample_2.fq.gz)代替sample_1.fq sample_2.fq; 或者使用这种形式zcat *fq.gz | jellyfish count /dev/fd/0,其中/dev/fd/0是进程输入标志,代表管道前结果传递。

  3. -m 17

    k-mer长度设置为17bp。如果基因组大小为G(单位是bp),k-mer长度推荐设置成log(200*G)/log(4)。500Mbp的基因组对应约为17,1Gbp的19,10Gbp的21。

  4. -s 1000M

    存储用的hash表大小为1000M,这个参数识别单位M(Mbp)和G(Gbp)。若该值不够大,则会生成多个hash文件,以数字区分文件名。最好设置的值大于总的独特的(distinct)k-mer数,这样生成的文件只有一个。如果基因组大小为G,每个reads有一个错误,总共有n条reads,则该值可以设置为[(G + n)/0.8]。

  5. -t 12

    线程12

  6. -C

    对DNA正负链都进行统计,表示考虑DNA正义与反义链,遇到反义kmer时,计入正义kmer频数中。如果是双端测序reads,需要这个参数。

  7. -o sample.jf

    结果文件名为sample.jf,会生成k-mer计数文件sample.jf,是hash的二进制文件。

  8. c 7

    k-mer的计数结果所占的最大比特数,默认支持的最大数字是2^7=128。该值最大,消耗内存越大。

  9. -out-counter-len=4

    输出的二进制hash文件中的计数结果所占的字节数,一个字节是8比特,则默认支持的最大数字是2^32=4.3G。

  10. 不推荐用-Q,会将低质量的碱基替换成N。
  11. -L

    不输出低于此值的k-mer

  12. -U

    不输出高于此值的k-mer

  13. 输出
  14. sample.jf

    hash格式储存的k-mer频数文件

4.2. histo —— 统计k-mer频率

  1. 命令

jellyfish histo -t 12 sample.jf > sample.histo

统计k-mer计数(sample.jf)得到k-mer频数分布直方表(sample.histo)。

  1. 参数
  2. -t 12

    线程12。

  3. -l 1

    x的最小值,默认是1。结果会将小于此值的所有的k-mer的数目作为(x‐1)的值总结到一行。

  4. -h 10000

    x的最大值,默认是10000。结果会将大于此值的所有的k-mer的数目作为(x+1)的值总结到一行。

  5. -i 1

    x轴取值间隔,每隔该数值取值,默认为1。

  6. 结果
  7. k-mer频数分布直方表(sample.histo)包含空格分隔的两列数据。
  8. 第一列代表k值出现的次数x(x=1,2,3...),第二列是出现了x次的kmer的种类的数量y。
  9. sample.histo的两列即是kmer分布频率直方图的x和y轴的值。

4.3. merge 合并【按需选择】

如果jellyfish count模块输出结果的二进制hash文件有多个,需要将多个hash文件合并,合并到merge.jf。

jellyfish merge sample_hash1.jf sample_hash2.jf sample_hash3.jf -o merge.jf

4.4. stats 统计【可选】

jellyfish stats sample.jf -o counts_stats.txt

可以用stats模块来统计出k-mer总数(Total),特异的k-mer数目(Distinct),只出现过一次的k-mer数量(Unique),频数最高的k-mer数量(Max_count)等信息。

5. 基因组特征评估

获得k-mer频数分布表sample.histo后,推荐用GenomeScope1.0或者GenomeScope2.0或者GenomeScope的R脚本来做基因组特征评估和画图。也可直接用R绘制sample.histo的频率分布直方图/频率分布曲线。

5.1. GenomeScope 网页版

5.1.1. GenomeScope1.0 网页版 —— 适用于二倍体物种

  1. GenomeScope1.0 网页版上传前一步获得的k-mer频数分布表sample.histo文件。
  2. 设置参数k-mer length为第一步选择的k-mer长度值,这里是17;参数Read length为序列读长,一般为150;最后一个参数Max kmer coverage建议修改成更大的10000,以统计更多的k-mers。
  3. 结果显示预估的基因组大小,杂合度,重复率等信息。

5.1.2. GenomeScope2.0 网页版 —— 适用于多倍体物种

GenomeScope2.0 网页版也是类似的步骤。

5.2. R绘制

R绘制k-mer频数分布曲线初步查看基因组特征。
获得kmer_plot.png为频数分布曲线,可根据曲线峰值对基因组大小进行计算和预估。

#R 脚本示例
kmer <- read.table('sample.histo')
kmer <- subset(kmer, V1 >=5 & V1 <=500) #对频数范围5-500的数据进行绘制 
Frequency <- kmer$V1
Number <- kmer$V2
png('kmer_plot.png')
plot(Frequency, Number, type = 'l', col = 'blue')
dev.off()

6. references

  1. jellyfish paper:https://academic.oup.com/bioi...
  2. jellyfish github:https://github.com/gmarcais/J...
  3. jellyfish参数推荐:https://www.bilibili.com/read...
  4. chenlianfu blog: jellyfish参数推荐:http://www.chenlianfu.com/?p=806
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