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用k-mer分析进行基因组调查:(三)用KMC进行k-mer频数统计

枝叶

(全文约1300字)

【推荐】用Smudgeplot评估物种倍性后,用组合jellyfish+GenomeScope1.0做二倍体物种的基因组调查,用组合KMC+GenomeScope2.0做多倍体物种的基因组调查。

1. k-mer进行基因组调查的软件概况

k-mer进行基因组调查分为k-mer频数统计基因组特征评估两步。

  • KMC可以实现第一步k-mer频数统计。
  • KMC的结果sample.histo可以用在GenomeScope上,实现第二步基因组特征评估。

2. KMC 简介

  • KMC是一个用来从FASTQ/FASTA文件中计算k-mers的基于KMC二进制数据库的程序。
  • KMC是波兰的Silesian University of Technology的算法和软件学院的REFRESH Bioinformatics Group开发的工具。
  • 2017年发布了第三个版本,KMC3。
  • KMC是主要基于C语言的程序。

3. KMC 安装

  1. 版本

    有两个版本的KMC,一般使用第一个版本,Smudgeplot评估物种倍性时用到了第二个版本。

  2. 一个是REFRESH Bioinformatics Grouprefresh-bio/KMC
  3. 一个是GenomeScope2.0的开发团队tbenavi1修改的tbenavi1/KMC
  4. 下载

    KMC download找对应系统的最新版本KMC软件,下载解压缩即可使用。

mkdir KMC && cd KMC
wget https://github.com/refresh-bio/KMC/releases/download/v3.2.1/KMC3.2.1.linux.tar.gz #下载最新版本的KMC
tar -xzf KMC3.2.1.linux.tar.gz #解压缩和解包,生成bin文件夹和include文件夹
  1. 使用

    解压缩后bin目录下会包含可执行文件,可直接使用,建议加入环境变量,包括:

  2. bin/kmc:计算k-mer频数的主程序
  3. bin/kmc_dump:在kmc生成数据库中列出k-mers的程序
  4. bin/kmc_tools:允许操作kmc数据库的程序

4. KMC 运行

用KMC计算k-mer频率,生成k-mer频数直方表和k-mer直方图。

  1. 运行

    mkdir tmp #创建临时文件夹
    ls *.fastq.gz > FILES #用于分析的clean reads路径保存到文件FILES中
    kmc -k21 -t16 -m64 -ci1 -cs10000 @FILES kmcdb tmp #计算k-mer频率
    kmc_tools transform kmcdb histogram sample.histo -cx10000 #生成k-mer频数直方表sample.histo和k-mer直方图
  2. kmc命令参数
  3. -k21:k-mer长度设置为21
  4. -t16:线程16
  5. -m64:内存64G,设置使用RAM的大致数量,范围1-1024。
  6. -ci1 -cs10000:统计k-mer coverages覆盖度范围在[1-10000]的。
  7. @FILES:保存了输入文件列表的文件名为FILES
  8. kmcdb:KMC数据库的输出文件名前缀
  9. tmp:临时目录
  10. kmc_tools命令参数
  11. -cx10000:储存在直方图文件中counter的最大值。
  12. 结果

    生成的sample.histo可用于第二步GenomeScope的分析。

5. 基因组特征评估

获得k-mer频数分布表sample.histo后

  • 推荐用GenomeScope1.0或者GenomeScope2.0或者GenomeScope的R脚本来做基因组特征评估和画图。
  • 也可直接用R绘制sample.histo的频率分布直方图/频率分布曲线。

5.1. GenomeScope 网页版

5.1.1. GenomeScope1.0 网页版 —— 适用于二倍体物种

  1. GenomeScope1.0 网页版上传前一步获得的k-mer频数分布表sample.histo文件。
  2. 设置参数k-mer length为第一步选择的k-mer长度值,这里是17;参数Read length为序列读长,一般为150;最后一个参数Max kmer coverage建议修改成更大的10000,以统计更多的k-mers。
  3. 结果显示预估的基因组大小,杂合度,重复率等信息。

5.1.2. GenomeScope2.0 网页版 —— 适用于多倍体物种

GenomeScope2.0 网页版也是类似的步骤。

5.2. R绘制

  • R绘制k-mer频数分布曲线初步查看基因组特征。
  • 获得kmer_plot.png为频数分布曲线,可根据曲线峰值对基因组大小进行计算和预估。
#R 脚本示例
kmer <- read.table('sample.histo')
kmer <- subset(kmer, V1 >=5 & V1 <=500) #对频数范围5-500的数据进行绘制 
Frequency <- kmer$V1
Number <- kmer$V2
png('kmer_plot.png')
plot(Frequency, Number, type = 'l', col = 'blue')
dev.off()

6. references

  1. KMC3 paper:https://academic.oup.com/bioi...
  2. refresh-bio/KMC:https://github.com/refresh-bi...
  3. tbenavi1/KMC github:https://github.com/tbenavi1/KMC
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