文献阅读 | BMC Biology | 单细胞空间转录组分析揭示了发育中出生后小脑颗粒细胞和髓母细胞瘤的常见和不同特征

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文献介绍

文献题目： 单细胞空间转录组分析揭示了发育中出生后小脑颗粒细胞和髓母细胞瘤的常见和不同特征 \
研究团队： 王佳（上海交通大学）、杨茹（上海交通大学）、高维强（上海交通大学）\
发表时间： 2021-07-01 \
发表期刊： BMC Biology \
影响因子： 7.4（2021年）\
DOI： 10.1186/s12915-021-01071-8
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摘要

Background\
小脑（Cerebellar）神经发生涉及小脑发育过程中大量颗粒神经元（Granule Neurons, GNs）的生成，这一过程需要严格调控颗粒神经元前体细胞（Granule Neuron Progenitors, GNPs）的增殖和分化。一些转录调控因子（如 Math1）以及信号分子（如 Wnt 和 Shh）已被证明在 GNPs 的增殖和分化中起重要作用，而颗粒神经元发育的失调与髓母细胞瘤的发病机制相关。尽管小脑颗粒细胞的前体/分化状态已被广泛研究，但发育分化程序与空间基因表达模式之间的详细关联，以及这些如何导致不同类型髓母细胞瘤的差异生成，仍然知之甚少。本文通过比较单细胞空间转录组学分析，旨在更好地理解发育中的颗粒细胞与髓母细胞瘤细胞之间的相似性和差异。

Results\
为了更深入地了解发育中小脑颗粒细胞的精确细胞状态，作者对来自颗粒神经元特异性报告小鼠（Math1-GFP; Dcx-DsRed 小鼠）的 24,919 个小鼠小脑细胞进行了单细胞 RNA 测序。作者的单细胞分析揭示了发育中小脑颗粒细胞的四种主要状态，包括两种颗粒前体细胞亚群和两种分化/已分化的颗粒神经元亚群。进一步的空间转录组学技术使作者能够可视化这些细胞在小脑中的空间位置。此外，作者对 18,372 个来自Patched+/− 突变小鼠的细胞进行了单细胞 RNA 测序，发现髓母细胞瘤中的转化颗粒细胞与不同分化状态的发育中颗粒神经元非常相似。然而，与正常发育中的细胞相比，髓母细胞瘤中的转化颗粒神经元前体细胞表现出明显较低的分化倾向。

Conclusion\
总之，作者的研究揭示了小脑颗粒细胞详细状态的细胞和空间组织，并为正常小脑发育与肿瘤发生之间的相似性和差异提供了直接证据。

前言

小脑颗粒神经元前体细胞（Granule Neuron Progenitors, GNPs）是研究大脑发育中神经元增殖和分化调控的绝佳模型。GNPs 在出生后的前两周在外颗粒层（External Granule Layer, EGL）中广泛增殖，EGL 是一个短暂的次级生发区。随后，这些细胞退出细胞周期并向内迁移至内颗粒层（Internal Granule Layer, IGL），在那里分化为成熟的颗粒神经元（Granule Neurons, GNs）。许多研究报道了多种调控因子，包括转录因子（TFs）和环境信号，参与 GNs 的增殖、迁移和分化。例如，Math1 是最著名的转录因子之一，它在发育早期短暂表达于 EGL 中，是 GNPs 扩增所必需的。

神经元前体细胞增殖的调控对于健康的大脑发育至关重要，而这一基本发育事件的失调与脑癌的发生有关。髓母细胞瘤（Medulloblastoma, MB）是最常见的儿童脑肿瘤之一，其起源于小脑发育的失调。基于基因表达分析的现有知识已确定了 MB 的四种主要分子亚型，即 WNT-MB、Sonic hedgehog（SHH）-MB、group 3 MB 和 group 4 MB。多年来，通过细胞谱系追踪策略研究了 MB 的细胞起源。最近，多个研究团队利用单细胞基因组学方法将不同的 MB 表型与假定的起源细胞联系起来。这些研究表明，每种 MB 亚型都源自特定的起源细胞，从而决定了疾病的临床和分子行为。例如，SHH-MB 组约占所有 MB 的 30%，已被证明起源于颗粒前体细胞。

scRNA-seq 促进了发育中小脑和 MB 中细胞类型的转录组分类。然而，这些单细胞研究并未详细研究与 GNs 前体/分化程序相关的细胞状态。此外，单细胞测序涉及组织解离的预处理步骤，这会导致空间信息的丢失。最近的空间转录组学（Spatial Transcriptomics, ST）进展克服了这一挑战，尽管该方法在提供单细胞分辨率方面仍存在局限。

在本研究中，作者重点关注发育中的 GNs，旨在阐明其细胞状态和谱系轨迹。作者结合了 scRNA-seq 和 ST 技术（Fig. 1a），对出生后早期小鼠小脑中的细胞亚群及其空间位置进行了分析。此外，作者对 Patched+/− 突变小鼠中发展的三个 MB 肿瘤进行了 scRNA-seq，获得了肿瘤细胞的单细胞转录组。随后，作者进行了比较分析，以评估正常发育中的 GNs 与肿瘤细胞之间的相似性和差异。这些发现将有助于更广泛地理解前体/分化平衡及其与 MB 肿瘤发生的相关性。

研究结果

1. 出生后小脑细胞的单细胞转录组分析

作者之前使用 Math1-GFP 和 Dcx-DsRed 报告小鼠品系研究了发育中的颗粒神经元（GNs）的细胞分裂模式。如 Fig. 1b 所示，GFP+ 高表达细胞代表表达 Math1 的颗粒神经元前体细胞（GNPs），而红色荧光标记的细胞对应于表达 Dcx 的分化中的 GNs。在本研究中，为了聚焦 GN 的发育，作者对从转基因小鼠出生后小脑组织中分离的 Math1-GFP+ 和 Dcx-DsRed+ 细胞进行了 scRNA-seq。荧光标记的细胞通过荧光激活细胞分选（FACS）从出生后第 7 天和第 11 天（P7 和 P11）的小脑组织中分离，因为 GN 细胞在出生后的前两周内经历大规模的增殖和分化。

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a. 工作流程，上图展示了通过 FACS 分选、单细胞测序和分析来自 Math1-GFP 小鼠的两个样本（P7、P11）和来自 Dcx-DsRed 小鼠的两个样本（P7、P11）的小脑收集过程。下图展示了来自野生型（WT）小鼠的两个样本（均在 P7）的小脑切片、空间转录组和分析过程。\
b. 从转基因 Math1-GFP 和转基因 Dcx-DsRed 小鼠中建立的品系。比例尺：100 μm。\
c. 来自 FACS 分选样本的 24,919 个细胞的 t-SNE 可视化（n = 4；Math1-GFP 小鼠在 P7 和 P11；Dcx-DsRed 小鼠在 P7 和 P11）。细胞根据细胞类型注释的聚类进行着色。\
d. 每个细胞类型中标记基因表达的气泡图。颜色表示每个细胞类群中的平均表达，大小表示表达标记基因的细胞比例。\
e. 来自 FACS 分选样本的 24,919 个细胞的 t-SNE 可视化：Math1-GFP+ 和 Dcx-DsRed+ 样本。\
f. 条形图显示 Math1-GFP+ 和 Dcx-DsRed+ 样本中细胞类型的比例。P < 0.0001。P 值通过皮尔逊卡方检验确定。
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经过质量控制（包括去除双细胞）后，作者获得了总共 24,919 个 FACS 纯化的细胞。使用 t-SNE 进行无监督聚类，揭示了 13 个细胞类群（Fig. 1c）。根据文献中已知的标记基因注释，作者将这些细胞类群分为八种细胞谱系，包括 GNP/GN 细胞（表达 Math1、Barhl1、Pax6）、GABAergic 前体细胞（GABAergic pro）（表达 Ptf1a、Ascl1、Lhx5）、GABAergic 中间神经元（GABAergic int）（表达 Pax2、Lbx1）、星形胶质细胞（表达 Fabp7、Slc1a3、Aldh1l1、Aqp4）、少突胶质细胞（表达 Olig1、Olig2、Pdgfra）、成纤维细胞（表达 Col1a1）、小胶质细胞（表达 Aif1、Cd68、Tmem119）、以及纤毛细胞（表达 Dynlrb2、Meig1）（Fig. 1d）。作者发现，Math1-GFP+ 分选细胞中 GNPs/GNs 的比例显著高于 Dcx-DsRed+ 分选细胞（Math1-GFP+ 细胞中占 92%，Dcx-DsRed+ 细胞中占 77%，P < 0.0001，皮尔逊卡方检验；Fig. 1e, f），这与 Dcx 在 GNs 和其他迁移神经元中广泛表达的事实一致。

考虑到基于 FACS 的分选策略可能会导致某些发育中的 GN 细胞群体/状态的丢失，作者还从野生型（WT）小鼠中收集了全小脑细胞进行 scRNA-seq（Additional file 1: Figure S1a）。作者从两个 WT 样本中获得了 20,367 个细胞，然后将其与从 Math1-GFP+ 和 Dcx-DsRed+ 报告小鼠中分离的细胞（45,286 个细胞）整合（Additional file 1: Figure S1b）。该分析显示，WT 小脑细胞中还存在两种额外的细胞类型，即浦肯野细胞（PCs，表达 Calb1 和 Car8）和单极刷细胞（UBCs，表达 Eomes）（Additional file 1: Figure S1f）。此外，星形胶质细胞（表达 Fabp7、Slc1a3、Aldh1l1、Aqp4）也主要来自未分选的样本（Additional file 1: Figure S1d and S1e）。值得注意的是，WT 样本中没有独特的颗粒神经元，表明作者的 FACS 策略没有导致任何 GN 亚群的丢失（Additional file 1: Figure S1d and S1e）。然而，可能是由于发育中小脑中颗粒神经元的高比例，作者的研究中的谱系追踪策略在富集颗粒神经元进行单细胞测序方面并未显示出明显优于 WT 样本的优势。

2. 识别与出生后 GN 发育相关的不同状态

颗粒神经元（GNs）的前体/分化状态已被许多先前的研究所表征，这些研究表明至少存在两个主要的 GN 细胞亚群，分别称为颗粒神经元前体细胞（GNPs）和颗粒神经元（GNs），它们在细胞周期活动和空间位置上有所不同。为了更好地理解与出生后 GN 细胞发育相关的细胞状态，作者通过计算分离并重新聚类了 Math1-GFP+ 和 Dcx-DsRed+ 细胞中的 GNPs/GNs，揭示了九个亚群（Fig. 2a）。其中五个亚群（cluster 2、3、4、5、6）高表达前体细胞标记物 Math1（Fig. 2c），而其余亚群（cluster 0、1、7、8）则显示出 Dcx 的上调表达（Fig. 2c），这与分化/已分化的细胞状态相对应。GNPs 已被证明具有高增殖潜力。与此一致，大多数表达 Math1 的细胞显示出显著的细胞周期活动上调（Fig. 2d）。相比之下，表达 Dcx 的细胞显示出下调的细胞周期活动，以及上调的基因集，这些基因集先前被用于突出分化/已分化的 GNs（Rbfox3、Grin2b、Neurod1）（Fig. 2d）。正如预期的那样，表达 Dcx 的细胞主要来自 Dcx-DsRed+ 分选样本（Fig. 2b）。相比之下，Math1-GFP+ 分选策略似乎无法富集 GNPs。作者推测这是由于 FACS 阈值设置为收集所有表达 Math1 的细胞，而不是 Math1 高表达的 GNPs（Additional file 1: Figure S1c）。

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a. 通过重新聚类后，来自 FACS 分选样本的 21,397 个颗粒神经元细胞（GNs）的 t-SNE 可视化。n = 4 只小鼠。它们分别是 P7 和 P11 的 Math1-GFP 小鼠，以及 P7 和 P11 的 Dcx-DsRed 小鼠。细胞根据聚类着色。\
b. FACS 分选样本来源的 t-SNE 可视化，包括 Math1-GFP+ 和 Dcx-DsRed+ 样本。\
c. GNPs（Math1）和分化/已分化 GNs（Dcx）的特征基因表达。\
d. 细胞周期和分化（Rbfox3、Grin2b、Neurod1）基因评分的 t-SNE 可视化。\
e. 来自 Monocle 3 模块分析的七个模块（Y轴）对 GNs（X轴）的评分。四个高度相关的模块被突出显示（模块A、B、C、D）。细胞和模块通过层次聚类排列。细胞周期基因的评分以及 Math1 和 Dcx 的表达按顶部顺序排列。\
f. 定义了四种细胞状态，对应于 e 中的四个主要模块。\
g. 显示了四个主要模块基因的评分。\
h. 热图描绘了四种 GN 状态中标记基因的表达水平，颜色编码对应 FACS 分选样本、聚类、细胞类型和细胞周期评分。\
i. GNPs（Math1、Srebf1、Tead2）、GNs I（Nhlh1、Ebf3、Sox4）、GNs II（Grin2b、Cntn1、Car10）的特征基因表达。原位杂交（ISH）数据来自 Allen Developing Mouse Brain Atlas。显示的是 P4 小鼠小脑。
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为了全面理解 GNs 的未分化/分化状态，作者接下来应用了 Monocle 3 中实现的 Moran's I 检验来解析潜在的转录模块。该分析识别了在 Monocle 3 中 Louvain 组分 clusters 内和 clusters 间差异表达的七个模块（Fig. 2e, Y-axis）。然后，所有 GNPs/GNs 用每个模块的代表性基因进行评分（Fig. 2e, X-axis）。通过层次聚类和随后的 GO 富集分析，这七个模块进一步分为四个主要模块（Additional file 4: Table S3），可能对应于 GN 细胞的四种不同状态（Fig. 2e, Additional file 1: Figure S2a）。模块 A 包含许多与核分裂和细胞周期相关的基因（Additional file 4: Table S3），对应于分裂中的表达 Math1 的 GNPs（Fig. 2e）。模块 B 在一小部分表达 Math1 的 GNPs 中高表达，这些 GNPs 的细胞周期活动下调，可能对应于非分裂的 GNPs（Fig. 2e）。相比之下，模块 C 和 D 通过 GO 分析被表征为与神经发生和神经元分化相关，在表达 Dcx 的非循环细胞中高度上调，表明可能存在两个分化的 GNs 亚群（Fig. 2e）。作者接下来根据这四个模块对单个细胞进行评分，将 GNPs/GNs 分为 dividing GNPs（对应于模块 A）、non-dividing GNPs（对应于模块 B）、GNs I（对应于模块 C）、GNs II（对应于模块 D）（Fig. 2f, g）。

作者接下来评估了这四种 GNs 状态的转录特征。如 Fig. 2h 所示，分裂和非分裂的 GNPs 都高表达与前体相关的特征基因（如 Math1、Barhl1、Hey1、Hes6），但在细胞周期相关基因表达上有所不同。除了已知的标记基因外，一些新的标记基因与 GNP 状态相关。例如，Srebf1 和 Tead2，这两个基因都被引入为大脑神经元发育的关键调节因子，在 GN 的前体状态中高表达。为了验证这一发现，作者随后通过 Allen Developing Mouse Brain Atlas 中的原位杂交（ISH）检查了它们的表达模式。如 Fig. 2 i 所示，Srebf1 和 Tead2 都在外 EGL 中表达，类似于 Math1 的表达。

作者接下来将注意力转向分化的 GNs，发现 GNs I 高表达 Vim、Ebf3、Apc2、Sox4、Nhlh2、Nhlh1（Fig. 2h）。在这些标记中，Vim 广泛与上皮-间质转化和细胞迁移相关，Nhlh1 是一个与迁移颗粒细胞前体分化开始相关的 TF。此外，Nhlh2 先前在 EGL 的前迁移区中被发现，GNPs 在此处经历神经元分化的初始阶段，而Apc2 缺陷的神经元可能会损害 GNs 的迁移。这些发现表明，GNs I 可能代表一组分化/迁移中的 GNs。与作者的预期一致，ISH 分析显示，GNs I 标记 Nhlh1 在内 EGL 中强烈表达（Fig. 2i）。在 GNs I 中检测到的其他标记，如 Sox4 和 Ebf3，也在内 EGL 中表达（Fig. 2i）。GNs II 高表达已被报道与 GN 分化相关的标记，如 Grin2b、Calb2、Cntn1，以及一个新的标记如 Car10。Grin2b、Calb2、Car10 的表达在 IGL 区域内被检测到（Fig. 2i），表明 GNs II 代表一组更成熟的 GNs。这些发现共同表明，发育中的 GNs 的精细细胞状态和相关特征基因在单细胞分辨率下被突出显示，揭示了出生后发育中 GNs 的四种不同状态。未来研究应探讨一些在发育中 GNs 中未报道的分子，如 Srebf1、Tead2、Vim、Sox4、Ebf3、Car10，是否在调节 GNs 的未分化/分化状态中起关键作用。

3. GNs 的细胞状态下的 TF 调节网络

细胞表型/状态由核心调控转录因子（TFs）控制，这些 TFs 与顺式调控元件（即调控子）相互作用，以指导转录程序。作者接下来利用 SCENIC 来识别与 GN 细胞中四种细胞状态相关的主要 TF 网络。结果显示，GN 细胞的四种状态由不同的调控子构建（Fig. 3a）。例如，正如预期的那样，分裂的 GNPs 由许多与细胞周期相关的调控子驱动，包括 E2f2 和 Ezh2（Fig. 3b）。有趣的是，非分裂状态的 GNPs 由一组独特的调控子调控，如 Zeb1 和 Hey1（Fig. 3b）。随后的原位杂交（ISH）检查证实，Zeb1 和 Hey1 在外 EGL 中表达（Fig. 3c）。GNs I 由 Neurod1 的调控子突出显示，Neurod1 先前已被证明可以终止 GNP 的增殖，从而促进迁移和分化。此外，作者发现 UBCs 的特定标记 Eomes 在 GNs I 中也上调（Fig. 3b）。在 ISH 中，Neurod1 阳性细胞在内 EGL 和分子层/浦肯野细胞层（ML/PCL）中富集，验证了 GNs I 的迁移状态（Fig. 3c）。GNs II 显示出 En1 调控子的显著上调，En1 在之前的报告中在 E17.5 时在内 EGL 中强烈表达。相比之下，En1 在整个小脑发育过程中具有动态表达模式。在 P4 时检查 En1 发现，大多数 En1 阳性细胞位于 IGL 中（Fig. 3c）。值得注意的是，GNs II 优先激活了许多在 GN 发育中尚未被表征的 TF 调控子，包括 Bmyc、Bcl3、Esrrg（Fig. 3b）。综上所述，SCENIC 分析支持出生后 GNs 显示出四种不同的状态。

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a. 网络显示了四种 GN 状态中调控子之间的相关性。节点根据细胞类型着色。边的宽度对应于调控子之间的相关性值。\
b. 基于二元调控子活性矩阵的 t-SNE 可视化。细胞根据四种细胞状态着色。四种 GN 状态中调控子活性的 t-SNE 可视化。\
c. Zeb1、Hey1、Neurod1 和 En1 在小鼠小脑中的表达。原位杂交（ISH）数据来自 Allen Developing Mouse Brain Atlas。显示的是 P4 小鼠小脑。
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4. 用 ST 鉴定小脑中的细胞群

尽管原位杂交（ISH）数据为已识别的 GN 亚群的空间定位提供了证据，但作者接下来使用空间转录组（ST）来捕获这些细胞类型更全面的空间信息。ST 在 P7 的两只 C57BL 小鼠的脑切片上进行（Additional file 1: Figure S3a），在 P7 发育中小脑的 H&E 染色切片上生成了总共 473 个单独的 spots。作者随后对空间（spot）基因表达谱进行了降维和聚类分析，并识别出九个亚群（Fig. 4a）。基于细胞类型标记的表达，这些亚群主要代表了分布在 EGL、ML/PCL、IGL-WM 区域的层富集神经元群体（Fig. 4b）。例如，cluster 2 和 6 的 spots 高表达 GNP 标记物，如 Mki67、Math1、Barhl1，对应于 EGL。cluster 5、7、8 的 spots 强烈表达 PC 标记基因（如 Calb1、Pcp4、Car8），映射到 ML/PCL。值得注意的是，由于 ST spot 的分辨率有限（55–100 μm），作者将 ML 和 PCL 合并在一起。接下来，作者将聚类后的点映射回它们在小脑切片中的原始坐标，发现 t-SNE 亚群被投影到不同的组织学注释中，支持基于 ST 基因表达识别空间区域的能力（Fig. 4c–d, Additional file 1: Figure S3b–S3c）。

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a. 对来自 P7 WT 小鼠小脑切片的 473 个 spots 进行降维和聚类分析。n = 2 只小鼠。它们是样本 I 和样本 II。样本 I 中每个聚类的注释解剖区域在 c 中指示。点根据聚类着色。\
b. 气泡图显示了与小脑解剖区域对应的细胞类型中代表性标记基因的表达。颜色表示每个聚类中的平均表达，大小表示表达标记基因的细胞比例。\
c–d. 将点映射到它们的空间位置，显示由标记基因定义的点定位于样本 I 中小脑的预期层。放大的组织结构图像显示在 F1–F4 中。比例尺：25 μm。\
e–f. 所有 scRNA-seq 识别的细胞类型与空间转录组学定义区域的交集分析。热图中的每个值如 f 中所述计算。所有细胞类型和小脑区域对使用相同的背景基因（16,293 个基因）。用于计算的细胞类型特异性和空间区域特异性基因的数量在 f 中显示。红色表示富集（显著高重叠；P值 < 0.05），蓝色表示耗竭（P值 > 0.05）。顶部的条形图表示 a 中定义的区域。
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为了进一步揭示 P7 小鼠小脑在时空概览中的细胞类型，作者接下来应用了交集分析来计算每对细胞类型特异性和区域特异性基因集之间的重叠，并进行了超几何检验以评估它们的重叠是否显著富集（P < 0.05）或耗竭（P > 0.05）相比于随机预期（for example see Fig. 4f; see "Methods"）。细胞类型与区域之间重叠的富集情况如 Fig. 4e 中的热图所示。作者发现，scRNA-seq 数据中出生后小脑的 GNP 和 GN 特异性基因分别与 ST 识别的 EGL 和 IGL 特异性基因集重叠（Fig. 4e；P < 0.001）。对于 GABA 能谱系细胞，GABA 前体细胞和中间神经元在 WM 中富集，如先前报道（Fig. 4e；P < 0.001），而 ML/PCL 确实富集了 PCs（Fig. 4e；P < 10−10）。正如预期的那样，WM 区域也富集了胶质谱系细胞，如星形胶质细胞和少突胶质细胞（Fig. 4e；P < 10−10）。此外，星形胶质细胞也在 ML/PCL 和 IGL 中富集（Fig. 4e；P < 0.05）。与已报道的类似，可能小鼠小脑皮层中存在三种类型的星形胶质细胞，PCL 中的 Bergmann 胶质细胞、WM 中的纤维星形胶质细胞和 IGL 中的原生质星形胶质细胞，导致了这种富集。然而，ST 似乎无法映射发育中小脑中星形胶质细胞在 EGL 的位置，因为几项研究报道，除了其他位置（ML/PCL、IGL 和 WM）外，EGL 内还存在一小部分散在的表达 Nestin 的星形胶质细胞前体。可能是 EGL 中颗粒细胞的高度富集减弱了星形胶质细胞前体的表型。此外，WM 区域也富集了小胶质细胞，与先前的研究一致（Fig. 4e；P < 10−10）。成纤维细胞在 EGL（Fig. 4e；P < 10−10）和 WM（Fig. 4e；P < 0.05）中均被检测到，纤毛细胞在 WM 中富集（Fig. 4e；P < 0.001）。综上所述，几乎所有小脑细胞谱系都可以准确定位在 ST 中，提供了 P7 发育中小脑的完整表征。通过将细胞类型映射到 ST，确保可以精确地子集化对应于 GN 细胞的区域以进行进一步研究。

5. 跨小脑区域的 GN 细胞类型亚群的识别和映射

EGL 专门产生 GN 前体细胞，这些前体细胞在出生后早期通过 ML/PCL 向内迁移到 IGL。作者进一步研究了 ST 数据中出生后 GNs 的亚群，并关注 EGL、ML/PCL、IGL 区域，丢弃了定义为 WM 的 60 个 spots，这些 spots 主要富集了胶质谱系细胞（Fig. 5a, c）。由于每个 ST spot 包含大约 30 个细胞，反映了混合的表达特征，作者接下来过滤了与其他细胞类型相关的特征基因，特别是 PCL 内的 PCs 以及其他细胞类型，包括在发育过程中可能位于 ML/PCL 的胶质细胞和 GABA 能谱系细胞（Additional file 1: Figure S4b）。这一步生成了总共 127 个与 GN 身份特异性相关的基因（Additional file 1: Figure S4b, Additional file 6: Table S5）。使用这个基因集，作者对每个 spot 进行评分（Fig. 5b, e），发现包括非分裂 GNPs 和分裂 GNPs 在内的 GNPs 在 EGL 中富集（P < 0.01；双侧未配对 Wilcoxon 检验），而 GNs I 在 ML/PCL 中富集（P < 0.01），表明它们在发育过程中的迁移作用。被认为是成熟 GNs 的 GNs II 在 IGL 中富集（P < 0.0001）。相关性分析也支持了 GN 细胞的四种状态与三层位置之间的对应关系（Fig. 5f）。

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a. 图 4a 中识别为 EGL、ML/PCL、IGL 的 spots 的 t-SNE 可视化。\
b. ST spots 中与四种 GN 状态特异性相关的基因评分。\
c. 与 GNs 发育相关的解剖区域的空间位置：EGL、ML/PCL、IGL。spots 根据层着色。\
d. P7 时 GNs 在不同发育阶段的细胞结构模型：a. EGL 中的 GNPs，b. EGL 内层和 ML/PCL 中的 migrating GNs，d. IGL 中的 mature GNs，c. ML/PCL 中的 Purkinje cells。\
e. 与三层位置对应的四种细胞状态的选定基因评分的提琴图。颜色代表四种细胞状态。\
f. 四种 GN 状态与三层位置之间的相关性。\
g. ST H&E 图像中 GNPs（Math1 和 Mki67）、GNs I（Mvd）、GNs II（Cntn1）的特征基因表达。
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接下来，作者检查了 ST H&E 图像中某些细胞类型标记的表达水平。如 Fig. 5g 所示，GNPs 的标记物如 Math1 和 Mki67 在 EGL 中表达，而 GNs I 特有的基因之一 Mvd 在 ML/PCL 中表达，IGL 区域表达 Cntn1，这与 Fig. 2h 中的 ISH 结果相似。总的来说，通过将 scRNA-seq 的四种细胞类型与 ST 数据的小脑组织进行映射，出生后 GN 细胞的细胞状态在空间上得到了描述，并与之前的 ISH 数据一致。然而，ISH 在其对可用原位探针的依赖性方面显示出局限性。因此，通过 ST 对 GN 细胞状态的概览使我们能够更好地理解 GN 细胞状态的表达模式。结合 ISH 和 ST 分析，确认 P7 时的 GN 细胞被彻底描述为从 EGL 中的GNPs、ML/PCL 中的迁移 GNs 到最终 IGL 中的成熟颗粒细胞的顺序，如 Fig. 5d 中的模型所示。

6. GN 谱系细胞中的发育轨迹

作者接下来试图通过使用 scVelo 进行细胞轨迹分析来阐明出生后颗粒细胞的谱系关系，scVelo 是 RNA 速率分析的新版本，它应用基于似然的动力学模型来解决全基因转录动力学。作者对每个单独样本进行了此分析，并观察到从 GNPs 到分化 GNs 的一致细胞分化趋势（Fig. 6a, Additional file 1: S5a–S5d）。例如，在 P7 Math1 阳性样本中，RNA 速率预测非分裂 GNPs 为根细胞，通过两条不同的路径指导细胞分化（Fig. 6a, c）。在 P7 Math1 阳性样本中，大量非分裂 GNPs 显示出向分裂 GNP 阶段（由 cell #1 表示，Fig. 6a, b）和随后的迁移 GNs（由 cell #3 表示，Fig. 6a, b）以及分化 GNs（由 cell #4 表示，Fig. 6a, b）的分化趋势。相比之下，在 P7 Math1 阳性样本中，有少数非分裂 GNPs 直接分化为迁移 GNs，而不经历过渡放大状态（由 cell #2 表示，Fig. 6a, b）。

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a. P7 Math1-GFP+ 小鼠 GNs 的 RNA 速率。\
b. 对应于四种 GN 状态的特定细胞的转移概率的 UMAP 可视化。\
c. 显示了 P7 Math1-GFP+ 小鼠的速率推断根/末端细胞、速度伪时序和细胞周期评分。\
d. 沿速度伪时序解析的基因表达动态显示了 top 似然排名 TFs（likelihood > 0）的清晰转录级联。\
e. 通过高似然识别驱动基因。沿速率伪时序的驱动基因表达动态表征了它们的活性。
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除了建模细胞动力学外，scVelo 分析还使作者能够研究细胞状态进展过程中可变基因的转录动力学。作者专注于可能作为细胞状态转换基础的 TF 基因。可视化未剪接与剪接 mRNA 丰度的比率显示，细胞状态相关 TFs 的表达受到严格控制（Fig. 6d）。例如，当细胞进入循环前体状态时，非分裂 GNP 标记物 Barhl1 和 Tead2 的表达下调（Fig. 6e）。相比之下，在 GNs I 时，在皮质神经发生和神经元迁移中起调节作用的 Neurod1 和 Scrt2 发生转换（Fig. 6e）。对于 GNs II，与神经分化相关的 Neurod2 开始增加表达，Esrrg 的转换与 SCENIC 结果一致（Fig. 3b）。总的来说，RNA 速率识别的伪时序排序揭示了从非分裂 GNPs 到分裂 GNPs、迁移颗粒细胞和最终成熟颗粒细胞的顺序。

7. 肿瘤细胞身份与发育中 GN 细胞起源之间的关系

先前的研究表明，SHH-MB 可能主要起源于出生后早期的 GN 细胞。作者接下来询问 MB 肿瘤细胞是否表现出类似于发育中 GNs 的状态。为此，作者对 Patched+/− 小鼠在 50 周后发展的 MB 进行了 scRNA-seq。经过包括去除双细胞在内的质量控制后，作者从三只小鼠（MB-1、MB-2、MB-3）发展的 MB 中获得了总共 18,372 个细胞（Fig. 7a）。根据文献中已知的标记基因注释，作者将九个类群的细胞分为四种细胞类型：GNP 样肿瘤细胞（表达 Math1、Grin2b）、小胶质细胞（表达 Aif1、Cd68）、T 细胞（表达 Cd3d、Cd3e）、内皮细胞（表达 Cldn5、Cdh5）（Additional file 1: Figure S6a）。作者接下来试图通过从单细胞转录组谱推断拷贝数变异（CNVs）来区分恶性细胞和非恶性细胞，如许多先前研究所述。正如预期的那样，该分析显示，与 P7 时的正常颗粒神经元相比，所有三个 MB 样本中的 GNP 样肿瘤细胞具有显著的CNVs（Fig. 7b），证实了它们的恶性身份。

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a. 在 Patched+/− 小鼠 50 周后发展的 MB 的收集、单细胞测序和聚类分析的工作流程。n = 3 只 Patched+/− 小鼠。它们是 MB-1、MB-2、MB-3。来自三个 MB 肿瘤的 18,372 个细胞中九个类群的 t-SNE 可视化。细胞根据细胞类型注释的聚类着色。\
b. 显示正常细胞（P7 WT 小鼠的 GNPs/GNs）和三个样本的肿瘤细胞的推断大规模 CNVs 的热图。\
c. MB 与发育中小脑神经谱系细胞之间平均相似性得分的热图。\
d. 三个 MB 肿瘤中四种 GN 细胞状态评分的 t-SNE 可视化。\
e. 代表 SHH-MB 元程序的 150 个基因在合并肿瘤细胞中的相对表达。指示了细胞周期程序阳性的细胞。\
f. 肿瘤细胞元程序（y轴）与颗粒神经元细胞四种细胞状态（x轴）之间基因集的 Jaccard 相似性。
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先前的单细胞分析表明，SHH-MB 在表型上类似于发育中的 GNs。与这一发现一致，k-最近邻（kNN）分析预测，这三个肿瘤在转录上与 GN 细胞谱系相似，而不是其他神经细胞谱系（Fig. 7c），支持了这三个肿瘤的 GN 起源。此外，作者使用 Scanorama 比较了肿瘤细胞与发育细胞类型之间的转录相似性，该工具在批次效应校正后整合了肿瘤细胞和发育神经谱系细胞类型数据集。该分析还显示，肿瘤细胞在转录上更接近 GN 细胞谱系（Additional file 1: Figure S7）。基于这一观察，作者接下来检查了肿瘤细胞状态是否重现了正常发育 GNs 的增殖/分化状态。为此，作者使用发育细胞的四种状态的特征对每个肿瘤细胞进行评分（Fig. 7d）。结果显示，每个肿瘤的肿瘤内状态与正常发育中的 GN 状态高度相似。对这些四种细胞状态相关特征基因的进一步检查支持了这一观察（Additional file 1: Figure S6b）。

为了对肿瘤内细胞状态有一个无偏见的理解，作者接下来应用非负矩阵分解（NMF）提取每个肿瘤特有的潜在转录程序。该分析揭示了四个在肿瘤之间共享的元程序（A、B、C、D）（Fig. 7e）。元程序 A 以细胞周期标记物为特征，如 Top2a 和 Mki67（Additional file 7: Table S6），表明所有肿瘤中都存在增殖的肿瘤细胞亚群。元程序 B 包含上述 GNP 相关基因，如 Math1 和 Zeb1，可能对应于每个肿瘤中的未分化前体细胞。元程序 C 由许多分化 GNs 的标记物定义，包括 Neurod1 和 Nhlh1，可能反映了肿瘤细胞的分化状态。此外，作者识别了一个与癌症代谢相关的元程序（元程序 D），由 Shmt2 和 Phgdh 突出显示（Additional file 1: Figure S6c）。为了将这些元程序与发育 GNs 的细胞状态联系起来，作者通过使用相关特征基因计算 Jaccard 指数来比较它们的相似性。正如预期的那样，细胞周期元程序 A 与分裂的 GNPs 高度相似，而前体样元程序 B 与非分裂的 GNPs 相似。分化相关的元程序 C 显示出与迁移 GNs 和成熟 GNs 的相似性（Fig. 7f）。此外，癌症代谢元程序 D 与发育 GNs 的任何状态都没有明显的相似性，表明代谢相关特征的上调可能是肿瘤特异性的。尽管如此，作者的单细胞分析表明，MB 具有与发育 GNs 相似的状态，这为理解肿瘤细胞的细胞状态提供了新的视角。

8. 描述肿瘤内细胞轨迹

为了进一步理解 MB 样本中的肿瘤内细胞状态，作者使用 scVelo 来可视化细胞-细胞转换趋势（Fig. 8a）。通过计算不同状态之间的细胞到细胞转换概率，作者发现非分裂 GNP 样和分裂 GNP 样肿瘤细胞都可以作为所有三个肿瘤中的致瘤细胞（根细胞）（Fig. 8a）。这与正常状态不同，在正常状态中，大多数根细胞被预测为非分裂 GNPs（Fig. 8a）。随后的转换概率量化分析支持，与正常发育小脑中的 GNPs 相比，分裂 GNP 样肿瘤细胞表现出更高的潜力产生非分裂 GNP 样肿瘤细胞，而不是分化的后代细胞，特别是在 MB-1 和 MB-2 中（P < 0.0001，皮尔逊卡方检验；Fig. 8b）。这一发现总体上支持了肿瘤前体样细胞显示出更多的自我更新潜力，在一定程度上阻碍了分化过程，这与先前的研究一致。

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a. 肿瘤细胞中四种 GN 细胞状态的 RNA 速率。\
b. 热图显示从分裂 GNPs 和分裂 GNP 样到四种细胞状态的转换比例。P < 0.0001。P 值通过皮尔逊卡方检验确定。\
c. 使用四种肿瘤细胞状态的 GSVA 评分对 SHH-MB 患者进行总生存期（OS）的单变量分析。P 值通过对数秩检验确定。\
d. 正常和肿瘤模型中分裂期差异表达基因分析的热图。条形图表示每个样本中的平均表达。\
e. 正常和肿瘤模型中分裂期差异表达基因的 GO 分析。
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为了理解正常发育和肿瘤发生之间的差异，作者接下来对转化 GN 和正常 GN 进行了基因集变异分析（GSVA）（Additional file 1: Figure S8a）。正如预期的那样，作者发现 SHH 信号通路在肿瘤细胞中过度激活，特别是在前体样肿瘤细胞中。此外，与 P7 和 P11 的 Math1 阳性小鼠相比，肿瘤样本中的其他肿瘤相关通路如细胞周期、代谢、干细胞、缺氧和 TGF-β 通路也上调。在这些肿瘤特异性通路中，一些通路如 tRNA 氨酰化通路、STAT5 通路和 ALKBH8 通路已被报道在多种癌症中促进癌症进展。作者接下来评估了这些通路的预后价值，发现共有八个通路可以预测人类 MB 总生存期的显著较差结果，包括细胞周期、缺氧、干细胞、tRNA 氨酰化、STAT5 和 ALKBH8 通路（Additional file 1: Figure S8b）。

最后，作者考虑了不同 GN 样肿瘤群体的临床意义。因此，作者使用四种肿瘤细胞状态的特征对 405 个人类 SHH-MB 大样本进行评分。作者发现，具有较高分裂 GNP 样信号的患者，其肿瘤可能包含更多的分裂 GNP 样肿瘤细胞，预后显著较差（P = 0.0205；对数秩检验；Fig. 8c）。这些数据表明，分裂 GNP 样肿瘤细胞在肿瘤进展的发展中起直接作用。对正常分裂 GNP 细胞和分裂 GNP 样肿瘤细胞的无偏见比较揭示了 332 个基因（Additional file 8: Table S7），这些基因在分裂 GNP 样肿瘤细胞中优先表达，包括前体相关基因（如Hes1、Atoh1、Zeb1、Mycn）和细胞周期基因（如 Cdkn2a、Cdkn1a、Pou4f1、Ube2b）（Fig. 8d）。相比之下，正常分裂 GNPs 上调了与神经元迁移（如 Neurod1、Dcx）和神经元分化（如Neurod2、Tubb2b、Pax6）相关的基因表达，GO 富集分析证实了这一点（Fig. 8e）。因此，这些对肿瘤内状态的详细分析突出了转化 GNs 和正常发育 GNs 之间的差异，尽管它们共享相似的未分化/分化状态。分裂 GNP 样肿瘤细胞显著上调细胞周期和前体相关基因程序，这在一定程度上抑制了 GNs 的成熟。

讨论

小脑颗粒神经元（GNs）占大脑中神经元的一半以上，主要在出生后早期阶段产生，在此期间 GNPs 经历广泛的增殖，随后迁移和成熟。在本研究中，作者旨在解析与出生后颗粒细胞发育相关的转录程序。通过对从报告小鼠（Math1-GFP 和 Dcx-DsRed 报告小鼠品系）中分离的细胞进行 scRNA-seq，作者构建了出生后 GNs 的单细胞转录组图谱。为了全面理解颗粒细胞发育的分化谱，作者使用 Monocle 3 的模块基因提取了它们的潜在转录程序。结果识别了出生后颗粒细胞的四种离散状态，包括分裂的 GNPs（高表达细胞周期基因）、非分裂的 GNPs（高表达 Math1、Barhl1、Tead2、Srebf1）、迁移的 GNs（表达Vim、Ebf3、Apc2、Sox4、Nhlh2、Nhlh1）和成熟的 GNs（表达 Grin2b、Cntn1、En1、Car10）。作者还识别了几个可能在 GNs 发育中起重要作用的新基因，如对应于 GNPs 的 Tead2 和 Srebf1，对应于迁移 GNs 的 Vim、Sox4、Ebf3，以及对应于成熟 GNs 的 Car10。通过 RNA 速率分析，作者检查了这些状态之间的分化趋势，发现大多数 GNs 遵循从非分裂 GNPs 到分裂 GNP 阶段，随后进入迁移 GNs，然后产生分化良好的 GNs 的分化轨迹。因此，作者的研究为出生后 GNs 的分化状态提供了更多见解。

然而，需要注意的是，作者当前研究中的发育样本并未涵盖小脑颗粒神经元从上菱形唇衍生的早期胚胎阶段。未来的研究需要表征小脑颗粒神经元的整个发育过程，并解析它们从胚胎阶段到出生后阶段的差异。

虽然基于液滴的高通量 scRNA-seq 允许捕获颗粒细胞分化的不同转录状态，但测序前的组织解离导致空间信息的丢失，从而限制了我们理解 GNPs 如何从 EGL 向 IGL 分化的能力。为了解决这一限制，作者接下来利用 ST 来映射 GNPs 如何从 EGL 向 IGL 分化。尽管 ST 在提供单细胞分辨率方面仍然有限（55–100 μm 分辨率），但能够可视化 GNs 四种不同状态的空间位置，并确认 GNs 代表位于 EGL 和 IGL 之间的分化/迁移 GNs 亚群。因此，整合 ST 和 scRNA-seq 分析有助于全面研究 GN 分化及其空间信息。

MB 是儿童中最常见的恶性脑肿瘤。MB 的起源细胞最近通过单细胞转录分析得以阐明，显示不同的 MB 亚型与发育中的小脑细胞亚型相关。在这些不同亚型中，SHH-MB 已被证明模仿 GNs 的发育程序，这与之前的谱系追踪研究一致，表明 SHH-MB 可以从 Math1 阳性的 GN 前体细胞启动。作者实验室之前观察到 Patched+/− 小鼠中 GNPs 的分化延迟，表现为 Math1 增加和 Dcx 减少，以及 Math1 阳性 GN 前体细胞的对称细胞分裂增强。为了更好地理解正常 GNs 和致瘤 GNs 之间的细胞命运偏差，作者接下来通过 scRNA-seq 分析了 Patched+/− 小鼠的三个 MB 样本。作者使用发育 GNs 的四种状态的特征来定义肿瘤细胞状态，发现 Patched+/− 小鼠中发展的 MB 显示出类似于出生后早期 GN 细胞的组成。值得注意的是，基于 RNA 速率的细胞分化轨迹分析显示，转化的 GNPs 表现出显著较低的分化潜力。值得注意的是，在分析的三个肿瘤样本中，前体-前体细胞状态转换的增加具有显著的可重复性，从而为肿瘤发生提供了有洞察力的证据。作者进一步探讨了在肿瘤进化过程中是否存在决定细胞状态的确定性程序。作者的结果显示，许多通路如细胞周期、代谢、干细胞、缺氧、TGFB、tRNA 氨酰化和 ALKBH8 在转化的颗粒细胞中显著上调。进一步的大样本分析表明，新识别通路的致癌活性强烈预测 SHH-MB 患者的不良预后。这些发现共同表明，针对侵袭性 SHH-MB 的先进治疗策略可能包括抑制维持未分化/增殖颗粒前体状态的信号通路。

总结

总之，本研究在单细胞水平上描绘了与出生后 GNs 不同状态相关的详细转录谱，并通过 ST 映射了它们的空间位置。因此，这些数据为未来研究小脑 GN 发育提供了重要资源。此外，作者的工作证实了前体样肿瘤细胞在驱动 SHH-MB 肿瘤发生中的主要作用，强调了在癌症治疗中靶向这一细胞亚群及相关信号通路的重要性。

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